Cet article présente un protocole simple et économique pour la simple isolation et la purification de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial de Nouvelle-Zélande lapin blanc.
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Article de méthode
Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont la source principale de cellule pour la thérapie cellulaire. MSCs du fluide synovial de la cavité articulaire susceptibles de servir pour l’ingénierie tissulaire du cartilage. MSCs de liquide synovial (SF-MSCs) ont été considérés comme des candidats prometteurs pour la régénération articulaire, et leur bénéfice thérapeutique potentiel a fait d’eux un sujet de recherche importants de la fin. SF-MSCs de la cavité du genou les lapins blancs de Nouvelle-Zélande peuvent être utilisés comme un modèle optimisé translationnel afin d’évaluer la médecine régénérative humaine. Au moyen de base CD90 cell activé magnétique tri technologies (MACS), ce protocole avec succès obtient lapin SF-MSCs (rbSF-MSCs) de ce modèle de lapin et plus pleinement montre le phénotype de la maîtrise de ces cellules par incitant à faire la différence à ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes. Par conséquent, cette approche peut être appliquée dans la recherche en biologie cellulaire et ingénierie tissulaire en utilisant des procédures et des équipements simples.
Introduction
MSCs ont été proposées comme une source précieuse pour la médecine régénérative, surtout pour les lésions du cartilage. MSCs, y compris les chondrocytes, ostéoblastes, adipocytes, myocytes squelettiques et viscérales cellules stromales, étendre largement les zones destinés à la transplantation de cellules souches en raison de leur forte expansion taux et lignées multiples différenciation possibles1. MSCs peuvent être isolés dans le squelette musculaire, membrane synoviale, la moelle osseuse et le tissu adipeux2,3,4. Résultats ont confirmé aussi la prése....
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Protocole
Toutes les expériences sur des animaux ont été menées selon les directives d’éthique Comité régionales, et toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité Shenzhen deuxième populaire de l’hôpital, Université de Shenzhen.
1. isoler et Culture les rbSF-CSM
-
Préparatifs de la procédure de l’animale
- Préparer le squelette-mature femme Nouvelle Zélande lapins blancs pour la collecte de rbSF-MSCs. effectuer un examen clinique des lapins un jour avant la procédure anesthésie et arthrocentèse.
Remarque : les examens physiques devrait inclure poids (2,0 à ....
- Préparer le squelette-mature femme Nouvelle Zélande lapins blancs pour la collecte de rbSF-MSCs. effectuer un examen clinique des lapins un jour avant la procédure anesthésie et arthrocentèse.
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Résultats
Isolement, Purification et la Culture des rbSF-MSCs :
Ce protocole utilise des MACS d’isoler rbSF-MSCs, basés sur l’expression du marqueur de surface MSC CD90. Un diagramme de flux de processus d’isolement des rbSF-MSCs, purification et la caractérisation et le protocole de culture in vitro est illustré à la Figure 1.
Morphologie des cellules après des cellules a.......
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Discussion
L’existence de MSCs dans le liquide synovial offre une alternative pour la thérapie cellulaire. Des études antérieures ont montré que les blessures sites contiennent des quantités plus élevées de cellules souches mésenchymateuses dans leur liquide synovial, qui peuvent être positivement corrélée avec la période post-traumatique5. Les MSCs dans le liquide synovial peuvent être bénéfiques au tissu pour améliorer la cicatrisation spontanée après une blessure18,
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Cette étude a été financée par les subventions suivantes : la Fondation des sciences naturelles de Chine (no 81572198 ; No. 81772394) ; le Fonds pour la Construction de haute niveau Discipline médicale de l’Université de Shenzhen (n° 2016031638) ; la Fondation de recherche médicale de la Province de Guangdong, Chine (no. A2016314) ; et Shenzhen projets Science et technologie (no. JCYJ20170306092215436 ; Lol JCYJ20170412150609690 ; Lol JCYJ20170413161800287 ; Lol SGLH20161209105517753 ; Lol JCYJ20160301111338144).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| réactifs | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Composant du milieu de culture MSCs |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | Milieu de différenciation des CSM |
| Solution saline isotonique | Litai, Chine | 5217080305 | Réactif de procédure d’arthrocentèse de cavité |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, sans Ca2+/Mg2+ |
| de veau fœtal (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Composant du milieu de culture des CSM Solution de |
| povidone iodée | Guangdong, Chine | 150605 | Agent de stérilisation |
| 75 % | éthanol Lircon, Chine | 170917 | Agent de stérilisation |
| 0,25 % Trypsine/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Réactif de dissociation cellulaire |
| 1 % Pénicilline-Streptomycine | Gibco Inc. | 15140-122 | Composant des CSM moyennes |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 microbilles conjuguées d’anticorps mMEDTA |
| CD90 | MiltenyiBiotec | 5160801456 | Pour le tri cellulaire activé magnétique |
| Pyruvate de sodium | Sigma-Aldrich | P2256 | Composant des CSM chondrogéniques différenciation |
| Dexaméthasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Composant de la différenciation ostéogénique des CSM |
| ITS | BD | 354352 | 1 %, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM |
| L-proline L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0,35 mM, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM |
| Acide L-ascorbique-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM |
| 3-isobutyl-1-méthylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0,5 mM, Composant de la différenciation adipogénique |
| Indométacine | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Composant de la différenciation adipogénique |
| TGF&beta ; 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM |
| &alpha ;-glycérophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Composant de la différenciation ostéogénique des CSM |
| Anticorps polyclonal CD34, FITC Bioss conjugué | bs-0646R-FITC | Marqueur de cellules souches hématopoïétiques | |
| Souris antilapin CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotéine (marqueur MSC) |
| CD45 (anticorps monoclonal) | Bio-Rad | MCA808GA | Marqueur de cellules souches hématopoïétiques |
| Anticorps CD105 Marqueur | Genetex | GTX11415 | MSCs |
| Alcool isopropylique | Sigma-Aldrich | I9030 | Précipite l’extraction de l’ARN phases organiques |
| Trichlorométhane | Wenge, Chine | 61553 | Extrait de l’ARN total |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolat d’ARN total |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japon | RR420A | Test PCR |
| kit de synthèse d’ADNc | Takara Bio, Japon | RR047A | Retranscrit à l’ADN complémentaire |
| Rouge Alizarine | Sigma-Aldrich | A5533 | Coloration des composés calciques |
| Bleu de toluidine | Sigma-Aldrich | 89640 | Coloration des tissus cartilagineux |
| d’huile Red O | Sigma-Aldrich | O1391L | Coloration des vacuoles lipidiques |
| Équipement | |||
| Séparateur MiniMACS | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | Pour le tri cellulaire activé magnétique |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | Pour le tri cellulaire activé magnétique |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | Pour le tri cellulaire activé magnétique |
| Crépine de cellule | FALCON Inc. | 352340 | 40 &mu ; Hémocytomètre en nylon ISOLAB |
| Inc. | 075.03.001 | Comptage de cellules | |
| Falcon Antenne de 100 mm Boîte | de | culture cellulaire | Corning |
| Tube de microcentrifugation | Axygen | MCT-150-C | Extraction d’ARN et PCR |
| Tubes à centrifuger | Sigma-Aldrich | 91050 | Centrifugeuse |
| à grande vitesse | Eppendorf | 5804R | Cellules de centrifugation |
| Cellule à dioxyde de carbone incubateur | Thermo scientific | 3111 | Culture cellulaire |
| PCR en temps réel Instrument | Life Tech | QuantStudio Réaction | en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel |
| Cytomètre en flux | BD Biosciences | 342975 | Analyseur de cellules |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfert du liquide |
| Cylindre de clonage | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isoler et prélever des colonies cellulaires individuelles |
| Seringue hypodermique stérile | Double-Dove, Chine | 131010 | Procédure d’arthrocentèse |
| Cage à lapin | Zhike, Chine | ZC-TGD | Retenir le lapin |
Références
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M.
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Réimpressions et autorisations
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