MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol
Summary
Fixés au formol des spécimens de paraffine représentent une source précieuse de biomarqueurs moléculaires des maladies humaines. Nous présentons ici un protocole de préparation du bibliothèque de cDNA en laboratoire, initialement conçu avec de l’ARN congelée fraîche et optimisé pour l’analyse des microARN archivés des tissus conservés jusqu’à 35 ans.
Abstract
– Archivés, classés cliniquement fixés au formol paraffine des tissus (FFIP) peuvent fournir des acides nucléiques pour des études rétrospectives et moléculaires du développement du cancer. En utilisant des lésions non invasives ou précancéreuses chez des patients qui développent plus tard une maladie invasive, analyses d’expression génique peuvent aider à identifier des altérations moléculaires précoces qui prédisposent au risque de cancer. Il a été bien décrit qu’acides nucléiques extraits des tissus FFPE ont subi de graves dommages physiques et des modifications chimiques, qui compliquent leur analyse et exige généralement des dosages adaptés. Cependant, microARN (miARN), qui représentent une petite classe de molécules d’ARN s’étendant sur plus de ~ 18 – 24 nucléotides, auraient dû être divulgués à résister au stockage à long terme et ont été analysés avec succès dans des échantillons FFPE. Nous présentons ici un 3′ avec code à barres ADN (cDNA) Bibliothèque préparation au protocole complémentaire spécialement optimisé pour l’analyse de petits ARN extraites des tissus archivés, qui a été récemment démontrée pour être robuste et hautement reproductible lors de l’utilisation archivées échantillons cliniques stockées jusqu’à 35 ans. Cette préparation de bibliothèque est bien adaptée à l’analyse multiplex de matériel compromise/dégradé où les échantillons d’ARN (jusqu’à 18) sont ligaturés avec barcoded adaptateurs individuels de 3′ et ensuite regroupées ensemble pour les préparations enzymatiques et biochimiques avant l’analyse. Toutes les purifications sont effectuées par sur gel de polyacrylamide (PAGE), qui permet des sélections de taille spécifique et enrichissements de petites espèces d’ARN avec code à barres. Cette préparation de bibliothèques d’ADNc est bien adaptée aux entrées de RNA minutes, comme une réaction en chaîne par polymérase pilote (PCR) permet la détermination d’un cycle d’amplification spécifique produire des quantités optimales de matériel pour l’ordonnancement de prochaine génération (NGS). Cette approche a été optimisée pour l’utilisation des dégradés FFIP ARN des spécimens archivés jusqu’à 35 ans et fournit des données hautement reproductibles de l’end.
Introduction
miARN est remarquablement bien conservés dans fixés au formol paraffine (FFIP) échantillons1,2,3. Travaux antérieur ont démontré que l’expression de ces courtes réglementaire non codantes unique échoués des molécules d’ARN peut être évalué avec succès à l’aide de l’ARN total des échantillons FFPE et fournir des données pertinentes d’expression par rapport à l’original frais tissus4,5,6,7,8. Par rapport aux ARN messagers de grande taille, qui se sont révélés d’être gravement affectés par FFIP traitement tissulaire (formaldéhyde, chaleur, dessiccation, etc.), des ribonucléases endogènes et l’âge des spécimens, la petite taille des miARN (~ 18 – 24 nucléotides) s’affiche pour les rendre résistants à la dégradation et résilient pour l’entreposage à long terme, a également démontré par des études d’expression de miRNA qui surpassent les études ADN messagère haut débit dans les spécimens archivés9. les études d’expression de miRNA archivés sur des échantillons cliniques, qui ont principalement été réalisées dans les analyses à petite échelle, ont démontré que seul ou multiplexé des analyses par PCR quantitatives, différents types de microarray technologies et plus récemment NGS peut servir à évaluer l’expression des miARN préservée après l’optimisation de ces dosages10,11,12,13,14.
Étant donné que le dérèglement de miRNA expression a été associé au développement d’une variété de cancers humains et qu’il y a potentiellement une offre énorme de cliniquement annoté spécimens archivés, il est devenu évident que ces petits ARN molécules représentent une source prometteuse de potentiels du cancer biomarqueurs15,16,17,18. L’utilisation d’une technologie d’expression de gène de haut-débit comme NGS a l’avantage de fournir une évaluation globale de toutes les transcriptions de miRNA par rapport aux technologies ciblées comme la PCR et/ou microarrays19. Pour cette raison, un protocole optimisé, abordable et facilement applicable pour la préparation de bibliothèque de cDNA de petits ARN de plus vieux spécimens archivés pour NGS a été optimisé pour permettre des études rétrospectives à grande échelle de20.
Nous avons déjà établi un protocole d’extraction d’ARN/ADN simultané pour restauration séparée de l’ARN et l’ADN de plus vieux spécimens archivés, que nous avons trouvées pour surpasser les kits commerciaux contemporains21. À l’aide de ce protocole d’extraction, d’obtenir l’ARN total de tissus FFPE archivées pendant une période prolongée de temps, nous avons optimisé la préparation de banques d’ADNc pour NGS des miARN préservés dans les échantillons cliniques jusqu’à 35 ans. En outre, dans une étude récemment publiée, où nous avons préparé des banques d’ADNc de cliniquement classés carcinome canalaire in situ des spécimens (CCIS), nous avons identifié des miARN différentiellement exprimés qui ont été validées par PCR quantitative, qui indiquait que modifications de l’expression miRNA spécifiques peuvent être détectables dans les lésions de la CCIS de patients qui développent un cancer du sein par rapport aux lésions de la CCIS de patients qui ne développent pas de cancer du sein.
Si l’on considère le coût des trousses commerciales pour la préparation de petites banques d’ADNc de RNA, le potentiel de leur arrêt, ainsi que l’utilisation de réactifs/brevet protégé qui ne peut pas être optimisée, nous avons décidé d’adapter un publiées antérieurement en laboratoire et sans kit de 3′ Protocole bibliothèque préparation d’ADNc avec code à barres pour NGS de petits ARN archivées dans des échantillons FFPE, permettant l’analyse simultanée de 18 échantillons22. Ce protocole prévoit une procédure étape par étape idéale et robuste avec points de contrôle visuel et l’évaluation technique, qui critiquaient pour adaptation aux spécimens d’ARN FFIP, et a un fort potentiel d’application à d’autres sources de compromis ou difficile d’utiliser le matériel de RNA. Applicabilité du protocole original a été améliorée en remplaçant les marqueurs de taille marquée radioactivement avec fluorescentes (p. ex., SYBR Gold) détectables marqueurs de taille de RNA utilisés lors de la sélection des bibliothèques ligaturés sur grands gels de polyacrylamide. Ce protocole optimisé repose sur la ligature de barcoded adaptateurs de 3′ à 18 échantillons FFPE RNA individuels, qui sont alors regroupées ensemble pour subir une ligature des adaptateur 5′, transcription inverse, ainsi qu’une analyse PCR pilote pour adapté l’amplification de l’ADNc final Bibliothèque avant amplification PCR à grande échelle, purification et NGS sur un séquenceur haut débit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole de préparation de bibliothèque cDNA hautement reproductible et robustes pour NGS de petits ARN archivées dans des échantillons FFPE ARN est présenté dans ce protocole, qui est une version modifiée et optimisée de la procédure décrite par Hafner et al. 22
Toutes les étapes de ce protocole ont été optimisés pour une utilisation avec ancien archivé et compromis l’ARN total extraite des échantillons FFPE. L’étape clé du présent p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Thomas Tuschl, chef du laboratoire de biologie moléculaire des ARN, ainsi que des membres de son laboratoire pour leur soutien et pour le partage de la technologie mise au point dans son laboratoire et de la fourniture d’accès à l’oléoduc WashableMarker. Nous remercions également le Dr Markus Hafner partage son protocole et de fournir des descriptions détaillées sur toutes les étapes biochimiques et enzymatiques utilisées dans sa procédure initiale.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
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