Sequenciação de MicroRNA retrospectiva: Biblioteca de DNA complementar preparação protocolo usando amostras de RNA de parafina fixada em formol
Summary
Fixada em formol parafina espécimes representam uma fonte valiosa de biomarcadores moleculares de doenças humanas. Aqui nós apresentamos um protocolo de preparação de biblioteca de base laboratorial do cDNA, inicialmente projetado com RNA congelado fresco e otimizado para a análise de microRNAs arquivados de tecidos armazenados até 35 anos.
Abstract
-Arquivada, clinicamente classificados fixada em formol parafina os tecidos (FFPE) podem fornecer ácidos nucleicos para retrospectivos estudos moleculares de desenvolvimento de câncer. Por meio de lesões pré-malignas ou não-invasiva de pacientes que mais tarde desenvolvem doença invasiva, análises de expressão de gene podem ajudar a identificar cedo alterações moleculares que predispõem ao risco de câncer. Tem sido bem descrito que ácidos nucleicos recuperados de tecidos FFPE sofreram graves danos físicos e modificações químicas, que dificultam a sua análise e geralmente requer ensaios adaptados. MicroRNAs (miRNAs), no entanto, que representam uma pequena classe de moléculas de RNA, abrangendo apenas até ~ 18-24 nucleotídeos, foram mostrados para suportar o armazenamento a longo prazo e foram analisadas com sucesso em amostras FFPE. Aqui apresentamos um 3′ código de barras complementares DNA (cDNA) biblioteca preparação protocolo otimizado especificamente para a análise de pequenos RNAs extraído de tecidos arquivados, que recentemente foi demonstrada para ser robusto e altamente reprodutível quando usando arquivados amostras clínicas armazenadas por até 35 anos. Esta preparação da biblioteca está bem adaptada à análise do material comprometido/degradado onde amostras do RNA (até 18) são ligadas com adaptadores de código de barras individual 3′ e depois agrupadas para preparações enzimáticas e bioquímicas subsequentes multiplex antes da análise. Todas purificações são executadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), que permite seleções de tamanho específico e avanços de código de barras pequenas espécies de RNA. Esta preparação de biblioteca de cDNA é bem adaptada ao minutos entradas de RNA, como um piloto cadeia da polimerase (PCR) permite a determinação de um ciclo de amplificação específica produzir quantidades ideais de material para o sequenciamento de próxima geração (NGS). Esta abordagem foi otimizada para o uso do RNA de FFPE degradadas das amostras arquivadas por até 35 anos e fornece dados NGS altamente reprodutíveis.
Introduction
os miRNAs são notavelmente bem conservados no fixada em formol parafina (FFPE) espécimes1,2,3. Trabalhos anteriores têm demonstrado que a expressão destas curtas reguladoras não-codificantes único encalhado RNA moléculas pode ser avaliada com êxito usando o RNA total das amostras FFPE e fornecer dados da expressão do gene relevante quando comparado com o original fresh tecidos4,5,6,7,8. Quando comparado aos RNAs Mensageiro de grande porte, que foram mostrados para ser afectados criticamente por FFPE processamento do tecido (formaldeído, calor, desidratação, etc.), RNases endógenas e a idade dos espécimes, o tamanho pequeno de miRNAs (~ 18 – 24 nucleotídeos) aparece para torná-los resistentes à degradação e resiliente para armazenamento a longo prazo, também demonstrado através de estudos de expressão de miRNA que superam os estudos de mRNA do elevado-throughput em espécimes arquivados9. estudos de expressão de miRNA utilizando amostras clínicas arquivadas, que na sua maioria foram realizadas em análises em pequena escala, tem demonstrado esse single ou multiplexado ensaios PCR quantitativos, diferentes tipos de tecnologias de microarray e mais recentemente NGS pode ser utilizada para avaliar a expressão de miRNAs preservadas após a otimização desses ensaios10,11,12,13,14.
Dado que o dysregulation do miRNA expressão tem sido associada com o desenvolvimento de uma variedade de neoplasias malignas humanas e que há potencialmente um enorme suprimento de clinicamente anotada espécimes arquivados, tornou-se aparente que estes pequenos RNA moléculas representam uma fonte promissora de câncer potenciais biomarcadores15,16,17,18. O uso de uma tecnologia de expressão do gene de alto rendimento como NGS tem a vantagem de fornecer uma avaliação global de todas as transcrições de miRNA quando comparado a tecnologias específicas como PCR e/ou microarrays19. Por esta razão, um protocolo otimizado, acessível e facilmente aplicável para preparação de biblioteca de cDNA de RNAs pequeno de espécimes arquivados mais velhos para NGS foi otimizado para permitir estudos retrospectivos em grande escala20.
Anteriormente, nós estabelecemos um protocolo de extração de RNA/DNA simultâneo para recuperação separado de RNA e DNA de espécimes arquivados mais velhos, que encontramos outperform contemporânea jogos comerciais21. Usando este protocolo de extração, para obter o RNA total de tecidos FFPE arquivados por longo período de tempos, nós aperfeiçoamos a preparação de bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs preservados em amostras clínicas por até 35 anos. Além disso, em um estudo publicado recentemente, onde preparamos bibliotecas de cDNA de carcinoma ductal clinicamente classificada em situ espécimes (DCIS), identificamos os miRNAs diferencialmente expressos que foram validados por PCR quantitativo, que indicou que mudanças de expressão de miRNA específico podem ser detectáveis em lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que desenvolvem câncer de mama quando comparadas às lesões de carcinoma ductal in situ de pacientes que não desenvolvem câncer de mama.
Considerando o custo de kits comerciais para preparação de pequenas bibliotecas de cDNA de RNA, o potencial de sua interrupção, bem como a utilização de reagentes protegidos por direitos autorais/patente que não pode ser otimizado, decidimos adaptar um anteriormente publicados baseado em laboratório e sem kit de 3′ código de barras do cDNA biblioteca preparação protocolo para NGS de RNAs pequeno Arquivado em espécimes FFPE, permitindo a análise simultânea de 18 amostras de22. Este protocolo fornece um procedimento passo a passo ideal e robusto com pontos de verificação visual e técnicas de avaliação, que foram fundamentais para a adaptação aos espécimes FFPE RNA, e tem um forte potencial para aplicação em outras fontes de comprometido ou difícil usar material de RNA. Aplicabilidade do protocolo original foi melhorada substituindo tamanho marcado radioactivamente marcadores fluorescentes (por exemplo, SYBR Gold) marcadores de tamanho de RNA detectáveis usados durante a seleção das bibliotecas ligadas na grande gel de poliacrilamida. Este protocolo otimizado depende a ligadura dos adaptadores de código de barras 3′ para 18 amostras de RNA FFPE individuais, que são então agrupados para se submeter a 5′ ligadura de adaptador, reverso-transcrição e uma análise PCR piloto para adaptados a amplificação do cDNA final biblioteca antes da amplificação do PCR em grande escala, purificação e NGS em um sequenciador de alto rendimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo de preparação de biblioteca de cDNA altamente reprodutível e robusto para NGS de RNAs pequeno Arquivado em amostras de RNA FFPE é apresentado no presente protocolo, que é uma versão modificada e otimizada do procedimento descrito por Hafner et al . 22
Todas as etapas do presente protocolo foram otimizadas para uso com mais antigo arquivado e comprometido o RNA total recuperado de espécimes FFPE. A etapa chave do presente protocolo, para o pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Thomas Tuschl, chefe do laboratório de biologia molecular de RNA, bem como membros de seu laboratório por seu apoio e para compartilhar a tecnologia desenvolvida no seu laboratório e fornecendo acesso ao pipeline de RNAworld. Agradecemos também o Dr. Markus Hafner para o protocolo de compartilhamento e fornecendo descrições detalhadas sobre todos os passos bioquímicos e enzimáticos utilizados em seu procedimento inicial.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
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