Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso
Summary
Esemplari di paraffina-incastonati formalina-fisse rappresentano una preziosa fonte di biomarcatori molecolari delle malattie umane. Qui presentiamo un protocollo di preparazione libreria cDNA laboratorio-basato, inizialmente progettato con RNA congelato fresco e ottimizzato per l’analisi dei microRNA archiviati dai tessuti stored fino ai 35 anni.
Abstract
– Archiviata, clinicamente classificati formalina tessuti paraffina-incastonati (FFPE) è in grado di fornire acidi nucleici per studi retrospettivi molecolari dello sviluppo del cancro. Utilizzando lesioni non invasive o pre-maligne da pazienti che successivamente sviluppano la malattia invasiva, analisi di espressione genica possono contribuire ad identificare le alterazioni molecolari iniziali che predispongono al rischio di cancro. È stata descritta bene che gli acidi nucleici recuperati dai tessuti FFPE hanno subito gravi danni fisici e modificazioni chimiche, che rendono difficile la loro analisi e generalmente richiede dosaggi adattati. I microRNA (Mirna), tuttavia, che rappresentano una piccola classe di molecole di RNA che coprono solo fino a ~ 18 – 24 nucleotidi, hanno dimostrato di resistere a deposito a lungo termine e sono state analizzate con successo in campioni FFPE. Qui presentiamo un 3′ con codice a barre del DNA (cDNA) Biblioteca preparazione protocollo complementare specificamente ottimizzato per l’analisi di piccole molecole di RNA estratto dai tessuti archiviati, che recentemente è stata dimostrata per essere robusto e altamente riproducibile quando utilizzando archiviati campioni clinici memorizzati fino a 35 anni. Questa preparazione di libreria è ben adattata per l’analisi multiplex del materiale compromessa/degradato dove campioni di RNA (fino a 18) sono legati con singoli 3′ adattatori con codice a barre e poi sommati insieme per le successive preparazioni enzimatiche e biochimiche prima dell’analisi. Tutte le purificazioni vengono eseguite mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina), che consente dimensioni specifiche selezioni e arricchimenti di piccole specie di RNA con codice a barre. Questa preparazione di libreria di cDNA è ben adattata al minuto ingressi di RNA, come un pilota catena della polimerasi (PCR) consente la determinazione di un ciclo di amplificazione specifica di produrre quantità ottimale di materiale per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questo approccio è stato ottimizzato per l’uso di RNA FFPE degradato dagli esemplari conservati per fino a 35 anni e fornisce dati NGS altamente riproducibili.
Introduction
Mirna sono straordinariamente ben conservati in formalina-fisso paraffina (FFPE) esemplari1,2,3. Lavoro precedente ha dimostrato che l’espressione di queste breve non codificanti singolo incagliato RNA molecole regolatorie possono essere correttamente valutate utilizzando RNA totale da campioni FFPE e fornire dati di espressione genica rilevanti rispetto ai freschi originale tessuti4,5,6,7,8. Rispetto al RNA messaggeri di grandi dimensioni, che hanno dimostrato di essere interessati in modo critico da FFPE processazione dei tessuti (formaldeide, calore, essiccazione, ecc.), RNasi endogene e l’età dei campioni, le piccole dimensioni dei miRNA (~ 18 – 24 nucleotidi) appare per renderli resistenti alla degradazione e resiliente per immagazzinaggio a lungo termine, hanno dimostrato attraverso studi di espressione di miRNA che superano le prestazioni studi di mRNA di alto-rendimento archiviati esemplari9. studi di espressione di miRNA utilizzando campioni clinici archiviati, che sono stati effettuati principalmente nelle analisi su piccola scala, hanno dimostrato quel singolo o multiplex analisi quantitative di PCR, diversi tipi di tecnologie di microarray e, più recentemente, NGS può essere usato per valutare l’espressione dei miRNA conservati dopo l’ottimizzazione di questi saggi10,11,12,13,14.
Dato che la disregolazione dell’espressione dei miRNA è stata associata con lo sviluppo di una varietà di malignità umane e che c’è potenzialmente un enorme apporto di clinicamente annotato archiviati esemplari, è diventato evidente che questi piccoli RNA molecole rappresentano una promettente fonte di potenziale cancro biomarkers15,16,17,18. L’uso di una tecnologia di espressione genica di alto-rendimento come NGS ha il vantaggio di fornire una valutazione globale di tutte le trascrizioni di miRNA rispetto a tecnologie mirate come PCR e/o microarrays19. Per questo motivo, un protocollo ottimizzato, accessibile e facilmente applicabile per la preparazione di libreria di cDNA di piccoli RNA da esemplari più vecchi archiviati per NGS è stato ottimizzato per consentire studi retrospettivi su larga scala20.
Precedentemente abbiamo stabilito un protocollo di estrazione di RNA/DNA simultaneo per recupero separato del RNA e DNA da esemplari più vecchi archiviati, che abbiamo trovato a sovraperformare contemporanea kit commerciali21. Usando questo protocollo di estrazione, per ottenere il RNA totale da tessuti FFPE archiviati per un periodo prolungato di volte, abbiamo ottimizzato la preparazione di librerie di cDNA per NGS di Mirna conservati nei campioni clinici per fino a 35 anni. Inoltre, in uno studio recentemente pubblicato, dove, abbiamo preparato le librerie di cDNA da classificate clinicamente il carcinoma duttale in situ esemplari (DCIS), abbiamo identificato Mirna differenzialmente espressi sono stati convalidati mediante PCR quantitativa, che indicava che cambiamenti di espressione di miRNA specifici possono essere rilevabili nelle lesioni DCIS da pazienti che sviluppano il cancro al seno rispetto alle lesioni DCIS da pazienti che non sviluppano il cancro al seno.
Considerando il costo del kit commerciali per la preparazione di piccole librerie di cDNA di RNA, il potenziale per la loro sospensione, così come l’uso di reagenti protetta da copyright/brevetto che non può essere ottimizzata, abbiamo deciso di adattare un precedentemente pubblicati laboratorio-basato e kit-gratuita 3′ protocollo di preparazione libreria cDNA da codice a barre per NGS di piccoli RNA archiviata negli esemplari di FFPE, che permette l’analisi simultanea di 18 campioni22. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata ideale e robusta con i checkpoint di valutazione visiva e tecnica, che erano critici per l’adattamento ai campioni FFPE RNA, e ha un forte potenziale per applicazione ad altre fonti di difficile o compromessa utilizzare materiale di RNA. Applicabilità del protocollo originale è stato migliorato sostituendo marcatore radioattivo etichettato con fluorescenti (ad es., SYBR Gold) indicatori di dimensione RNA rilevabili utilizzati durante la selezione delle librerie legate sul grande gel di poliacrilammide. Questo protocollo ottimizzato si basa sulla legatura della 3′ adattatori con codice a barre a 18 singoli campioni FFPE RNA, che sono poi riuniti insieme per subire la legatura 5′ adattatore, d’inversione-trascrizione e un’analisi PCR pilota per amplificazione del cDNA finale su misura Biblioteca prima dell’amplificazione PCR su larga scala, purificazione e NGS su un sequencer a resa elevata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocollo di preparazione altamente riproducibile e robusto cDNA biblioteca per NGS di piccoli RNA archiviata negli esemplari di FFPE RNA è presentato in questo protocollo, che è una versione modificata e ottimizzata della procedura descritta da Hafner et al. 22
Tutti i passaggi del presente protocollo sono stati ottimizzati per l’uso con vecchio archiviato e compromesso RNA totale recuperato da campioni FFPE. Il passaggio chiave del presente protocollo, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringrazia il Dr. Thomas Tuschl, capo del laboratorio di biologia molecolare del RNA, come pure i membri del suo laboratorio per il loro sostegno e per condividere la tecnologia sviluppata nel suo laboratorio e fornire l’accesso alla pipeline di RNAworld. Ringraziamo anche il Dr. Markus Hafner per suo protocollo di condivisione e di fornire descrizioni dettagliate su tutti i passaggi biochimici ed enzimatici utilizzati nella sua procedura iniziale.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
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