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Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

Published: June 18, 2018
doi:
10.3791/57474
, , , ,
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery,Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty,Rostock University

Summary

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Abstract

Enquanto CD133+ células-tronco hematopoiéticas (SCs) tem sido comprovadas para fornecer alto potencial no campo da medicina regenerativa, suas taxas de retenção baixa após a injeção em tecidos feridos, bem como as taxas de mortalidade observadas células maciça levam a muito restrito de efeitos terapêuticos. Para superar essas limitações, nós procurou estabelecer um protocolo baseado em não-viral para engenharia celular adequada antes da sua administração. A modificação de CD133 humana+ expressar SCs usando os polyplexes magnético microRNA (miR) carregado foi abordada em relação a eficiência de absorção e de segurança, bem como o alvo potencial das células. Confiando em nosso protocolo, podemos conseguir taxas de absorção alta miR de 80-90%, enquanto o CD133+ Propriedades de células-tronco permanecem inalteradas. Além disso, essas células modificadas oferecem a opção de segmentação magnético. Descrevemos aqui um procedimento seguro e altamente eficiente para a modificação de CD133+ SCs. Esperamos que esta abordagem para fornecer uma tecnologia padrão para otimização dos efeitos terapêuticos de células estaminais e para acompanhamento do produto celular administrado através de ressonância magnética (MRI).

Introduction

CD133+ SCs representam uma população de célula de tronco e progenitoras heterogénea com promissor potencial para a medicina regenerativa. Sua diferenciação hematopoiéticas, endoteliais e miogênico potencial1,2,3 permite o CD133+ células, por exemplo, contribuir para processos de neovascularização através da modulação em recém formando vasos e ativação de pro-angiogênico sinalização parácrina mecanismos4,5,6,7.

Apesar de seu alto potencial demonstrado em ensaios clínicos aprovados mais de 30 (ClinicalTrails.gov), seu resultado terapêutico é ainda sob polêmica discussão4. Na verdade, uma aplicação clínica de SCs é dificultada pela baixa retenção no órgão de interesse e enorme pilha inicial morte5,8,9. Produção adicional de CD133+ transplante prévio de SCs ajudasse a superar esses desafios.

Um pré-requisito para uma terapia celular eficiente seria a redução da morte maciça de pilha inicial para melhorar a enxertia de células relevantes terapêutico10. Estudos atuais demonstraram uma perda imensa pilha de 90 – 99% em órgãos altamente perfundidos, como o cérebro e o coração durante as primeiras horas de 1 – 2, independente do tipo de células transplantadas ou aplicativo rota11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC rotulagem usando nanopartículas magnéticas (MNPs) permite uma estratégia inovadora de não-invasivo para células-alvo para o site de interesse22,23,24,25,26 e simultaneamente permite que a célula de monitoramento usando MRI27 e partícula magnética (MPI) de imagem. O mais eficiente na vivo estudos aplicando magnetizada célula alvo de retenção célula usada após a administração local, em detrimento da orientação celular após injeção intravenosa23,24,28 . Portanto, o nosso grupo projetado um sistema de entrega consiste de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético29. Com esta técnica, CD133+ SCs e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) com eficiência poderiam ser alvo, como demonstrado em vitro tentativas de30,31.

Um outro obstáculo para terapias de SC é o ambiente hostil e inflamatório do tecido afetado após o transplante, o que contribui para a morte de pilha inicial32. Além de vários estudos de pré-condicionamento, a aplicação de terapêuticas miRs relevantes foi testado33; foi com sucesso demonstrado que anti-apoptotic miRs inibem a apoptose em vitro e realçam a enxertia de celular na vivo33. Estas pequenas moléculas, compostas por 20-25 nucleotides, desempenham um papel crucial como moduladores posttranscriptional de RNA mensageiro (mRNAs) e, portanto, afetam células estaminais destino e comportamento34. Além disso, a introdução exógena de miRs evitar a integração estável indesejada para o anfitrião do genoma34.

Atuais tentativas para introdução eficiente de ácidos nucleicos (NAs) em SCs primárias baseiam-se principalmente a vírus recombinante8,35. Apesar da eficiência elevada do transfection, manipulação de vírus recombinante apresenta um grande obstáculo para uma tradução de banco-de-cabeceira, por exemplo, expressão gênica incontrolável, patogenicidade, imunogenicidade e mutagênese insercional35 ,36. Portanto, sistemas de entrega não-virais como construções baseadas em polímero são fundamentais para desenvolver. Entre esses, o polyethylenimine (PEI) representa um veículo de entrega válido, oferecendo benefícios para miRs como condensação de ND para proteger da degradação, absorção celular, e liberação intracelular através de CDDP escapar37,38. Além disso, complexos de miR-PEI demonstraram uma alta biocompatibilidade em ensaios clínicos39. Portanto, nosso sistema de entrega consiste de um biotinilado ramificada 25 kDa PEI acoplado a um streptavidin-revestido MNP-núcleo30,31,40.

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente descrevendo (i) o isolamento manual de CD133+ SC de doação de medula óssea humana (BM) com uma caracterização detalhada do produto SC e (ii) uma estratégia de transfeccao eficiente e suave de um sistema baseado em polímero magneticamente não-virais entrega por engenharia genética de CD133+ SCs usando miRs. CD133+ SCs são isoladas e magneticamente enriquecido de humanos aspirados BM esternais, usando uma superfície baseado em anticorpos magnético-ativado da pilha classificação sistema (MACS). Depois disso, a viabilidade celular, bem como a pureza de célula é analisada usando citometria de fluxo. Posteriormente, miR/PEI/MNP complexos são preparados e CD133+ SCs são transfectadas. 18 h após a transfeccao, a eficiência de absorção e o impacto do transfection na viabilidade de expressão e célula de marcador de SC são analisados. Além disso, avaliação da distribuição dos compostos complexos transfeccao intracelular é executada usando rotulagem quatro cores e iluminação estruturada microscopia (SIM).

Protocol

Esternal BM humana para isolamento de célula foi obtido de doadores informados, que deu o seu consentimento por escrito para usar suas amostras para pesquisa de acordo com a declaração de Helsinque. O Comité de ética da Universidade de Rostock aprovou o estudo apresentado (reg. n. º A 23 2010, prolongada em 2015). 1. preparação da pilha Nota: Use heparina de sódio (250 UI/mL BM) para impedir a coagulação para exame de BM. CD133+</su…

Representative Results

O protocolo apresentado descreve um isolamento manual e magnético enriquecimento do humano BM-derivado CD133+ SCs com uma célula independente de vírus subsequentes engenharia estratégia, como uma tecnologia não-invasiva para manipulação de células em vitro e em vivo ferramenta de monitoramento. Esta tecnologia de isolamento de três etapas permite uma separação de multinacionais de BM ester…

Discussion

Nos últimos anos, CD133+ SCs surgiram como uma população celular promissor para terapias baseadas em SC, como evidenciado por vários fase I, II e III ensaios clínicos43,44,,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 <su…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Ministério Federal da educação e pesquisa Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com fundos estruturais (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e a DFG (DA1296/2-1), o Fundação coração alemão (F/01/12), o BMBF (VIP + 00240) e a Fundação úmida. Além disso, F.H. e P.M. são suportados pelo Forum programa de Rostock University centro médico (889001).

Materials

7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz
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Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).
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