Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

Summary

Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern⁺ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

Abstract

Während CD133⁺ Hämatopoetischen Stammzellen (SCs) erwiesen sich als um hohes Potenzial auf dem Gebiet der regenerativen Medizin zu bieten, ihre geringe Abscheideraten nach Injektion in das verletzte Gewebe sowie die massive beobachtete Sterbeziffern führen zu sehr eingeschränkten therapeutischen Wirkungen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir versucht, ein nicht-viralen basierte Protokoll für geeignete Zelle Engineering vor ihrer Verwaltung zu etablieren. Die Änderung der menschlichen CD133⁺ mit dem Ausdruck SCs mit magnetischen Polyplexes MicroRNA (MiR) geladen richtete sich in Bezug auf die Aufnahme-Effizienz und Sicherheit sowie das targeting Potential der Zellen. Unter Berufung auf unserem Protokoll, erreichen wir hohe MiR Inanspruchnahme von 80 – 90 %, während die CD133⁺ Stammzelle Eigenschaften bleiben unberührt. Darüber hinaus bieten diese veränderten Zellen die Möglichkeit der magnetischen Ausrichtung. Wir beschreiben hier ein sicheres und hoch effiziente Verfahren für die Änderung von CD133⁺ SCs. Wir erwarten, dass dieser Ansatz zu eine Standardtechnologie zur Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung des Messguts verabreichten Zelle per Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung zu stellen.

Introduction

CD133⁺ SCs repräsentieren eine heterogene Zellpopulation Stamm- und Vorläuferzellen mit vielversprechenden Potential für die regenerative Medizin. Ihre myogen hämatopoetischen und endothelialen Differenzierung möglicher^1,2,3 ermöglicht die CD133⁺ Zellen, z. B., Beitrag zur Neovaskularisation Prozesse durch eine Differenzierung in Schiffen und Aktivierung der Pro-angiogenen Signalisierung durch Parakrine Mechanismen^4,5,6,7neu bilden.

Trotz ihres hohen Potenzials in mehr als 30 genehmigten klinischen Studien (ClinicalTrails.gov) gezeigt ist ihre therapeutische Ergebnis noch unter kontroverse Diskussion⁴. In der Tat wird eine klinische Anwendung der SCs durch niedrige Retention in der Orgel von Zinsen und massive erste Zelle Tod^5,8,9behindert. Weitere engineering von CD133 könnte helfen, diese Herausforderungen zu meistern⁺ SCs vor Transplantation.

Eine Voraussetzung für eine effiziente Zelltherapie wäre die Reduktion von den massiven erste Zelltod, das Engraftment therapeutisch relevanten Zellen¹⁰zu verbessern. Aktuelle Studien zeigten eine immense Zellverlust von 90-99 % in höchst PERFUNDIERTEN Organen wie Gehirn und Herz während der ersten 1 – 2 Std., unabhängig von der Art der transplantierten Zellen oder Anwendung route^{11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21}. SC Kennzeichnung mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) ermöglicht eine innovative nicht-invasive Strategie an Zielzellen auf der Website von Interesse^{22,23,24,25,26} und gleichzeitig ermöglicht die Handy Überwachung mittels MRI²⁷ und magnetic Particle imaging (MPI). Die effizienteste in Vivo Studien Anwendung magnetisierten Zelle gezielt verwendete Zelle Aufbewahrung nach der lokalen Verabreichung bevorzugt Zelle Führung nach intravenöser Injektion^23,24,28 . Daher entwickelt unsere Gruppe ein Delivery-System bestehend aus superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln²⁹. Mit dieser Technik, CD133⁺ SCs und menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) effizient ausgerichtet sein könnte, wie durch in-vitro- Versuche^30,31.

Eine weitere Hürde für SC-Therapien ist die feindlichen entzündlichen Umgebung des betroffenen Gewebes nach der Transplantation, die auf die erste Zelle Tod³²beiträgt. Neben mehreren Vorkonditionierung Studien war die Anwendung der therapeutischen relevanten MiRs getesteten³³; Es wurde erfolgreich nachgewiesen, dass Anti-apoptotische MiRs Apoptose in Vitro hemmen und Zelle Engraftment in Vivo³³verbessern. Diese kleinen Moleküle, bestehend aus 20 – 25 Nukleotide, spielen eine entscheidende Rolle als posttranskritionelle Modulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs) und beeinträchtigen somit Stammzellen Schicksal und Verhalten³⁴. Darüber hinaus die exogene Einführung MiRs vermeiden unerwünschte stabile Integration in die Host-Genom-³⁴.

Aktuelle Versuche zur effizienten Einführung von Nukleinsäuren (NAs) in primäre SCs basieren meist auf rekombinante Viren^8,35. Trotz der hohen Transfektion Effizienz stellt rekombinanten Virus Manipulation ein großes Hindernis für eine Bank-zu-Bett-Übersetzung, z.B.unkontrollierbare Genexpression, Pathogenität, Immunogenität und insertional Mutagenese^{35 ,36}. Nicht-viralen-Delivery-Systeme wie Polymer-basierten Konstrukte sind daher kritisch zu entwickeln. Unter denen Polyethylenimine (PEI) stellt eine gültige Lieferfahrzeug bietet Vorteile für MiRs wie NA Kondensation zum Schutz vor Abbau, zelluläre Aufnahme und intrazellulären Freigabe durch Endosomal entgehen^37,38. Darüber hinaus zeigte MiR-PEI-komplexe eine hohe Biokompatibilität in klinischen Studien³⁹. Unser Liefersystem besteht also aus einem biotinylierte verzweigten 25 kDa PEI gebunden zu einem Streptavidin beschichteten MNP-Kern^30,31,40.

In diesem Manuskript präsentieren wir ein umfassendes Protokoll beschreiben (i) die manuelle Isolierung von CD133⁺ SC aus menschlichen Knochenmark (BM) Spende mit einer ausführlichen Charakterisierung von SC Produkt- und (Ii) ein effizientes und schonendes Transfektion von einem magnetisch nicht-viralen Polymer-basierten Liefersystem für gentechnische Veränderung von CD133⁺ SCs mit MiRs. CD133⁺ SCs sind isoliert und magnetisch aus menschlichen sternale BM Aspiraten mit einer Oberfläche Antikörper-basierten magnetisch aktivierte Zelle Sortieranlage (MACS) angereichert. Danach sind die Zellviabilität sowie die Zelle Reinheit mit Durchflusszytometrie analysiert. Folge MiR/PEI/MNP-komplexe sind vorbereitet und CD133⁺ SCs sind transfiziert. 18 h nach Transfektion, die Aufnahme-Effizienz und die Auswirkungen der Transfektion auf SC Marker Ausdruck und Zelle überleben werden analysiert. Darüber hinaus erfolgt Bewertung der intrazelluläre Verteilung der Transfektion komplexer Verbindungen mit vierfarbigen Kennzeichnung und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM).

Protocol

Sternale menschlichen BM für Zelle isoliert war informierte Spender entnommen, schenkte ihr schriftliche Einverständnis, ihre Proben für die Forschung nach der Deklaration von Helsinki zu verwenden. Die Ethikkommission der Universität Rostock hat die Studie (VO Nr. A 2010 23, im Jahr 2015 verlängert) genehmigt. 1. Zelle-Vorbereitung Hinweis: Verwenden Sie Heparin Natrium (250 IU/mL BM), Koagulation für BM Prüfung zu verhindern. CD133+</…

Representative Results

Die vorgestellte Protokoll beschreibt eine manuelle Isolation und magnetische Anreicherung von menschlichen BM abgeleitet CD133+ SCs mit einer anschließenden Virus unabhängige Zelle engineering-Strategie als eine nicht-invasive Technologie zur in-vitro- Zelle Manipulation und in Vivo monitoring-Tool. Diese Dreistufen-Isolierung-Technologie ermöglicht eine Trennung der multinationalen Konzerne aus …

Discussion

In den letzten Jahren, CD133⁺ SCs entstanden als eine viel versprechende Zellpopulation für SC-basierte Therapien wie von mehreren phase I, II und III klinischen Studien^{43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 …}

Materials

7-AAD	BD Biosciences	559925
Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell Technologies	7060	3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136)	Miltenyi Biotec GmbH	130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)	BD Biosciences	560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin	ATTO-TEC GmbH	AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2	BD Biosciences
BSA	Sigma-Aldrich GmbH	A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-049
collagenase B	Roche Diagnostics GmbH	11088831001
counting chamber	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1	Ambion	AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit	Mirus Bio	MIR 9650
DNAse I	Roche Diagnostics GmbH	10104159001	(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope	Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield	Sigma-Aldrich GmbH	F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS pre-separation filter	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407	30 µm
MACS separation column (MS / LS)	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-302
Millex-HV PVDF Filter	Merck	SLHV013SL	0.45 μm
mouse IgG 2b-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll	Pan Biotech GmbH	P04-60500	density: 1.077 g/mL
PBS	Pan Biotech GmbH	P04-53500	without Ca and Mg
PEI	Sigma-Aldrich GmbH	408727	branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100 μg/mL
PFA	Merck Schuchardt OHG	1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1	Ambion	AM17110
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Pan Biotech GmbH	P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100	Stemcell Technologies	2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000	Stemcell Technologies	9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles	Promega Corporation	Z5481
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich GmbH	T8154	0.4 %
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software	Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath	Bandelin electronic		Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz