Bu iletişim kuralı CD133 değiştirmek için güvenli ve verimli bir yordam gösterilmektedir+ hematopoietik kök hücre. Sunulan viral sigara, manyetik polyplex dayalı yaklaşım temel terapötik kök hücre etkileri de manyetik rezonans görüntüleme üzerinden yönetilen hücre ürün izleme gelince optimizasyonu için sağlayabilir.
Süre CD133+ hematopoietik kök hücre (SCs) rejeneratif tıp alanında yüksek potansiyel sağlamak için kanıtlanmıştır, yaralı doku hem de gözlenen büyük hücre ölüm oranları içine enjeksiyon sonra onların düşük tutma oranları çok yol sınırlı tedavi edici etkileri. Bu sınırlamalarını aşmak için bir viral tabanlı iletişim kuralı uygun hücre mühendisliği önce kendi yönetim için kurmak istedi. İnsan CD133 değişiklik+ yüklenmiş mikroRNA (miR) manyetik polyplexes kullanarak SCs ifade ele alımı verimliliği ve emanet gibi hücreleri hedefleme potansiyeli ile ilgili. Bizim iletişim kuralı üzerinde güvenerek, biz yüksek miR alımı CD133 ise % 80 – 90 oranda elde edebilirsiniz+ kök hücre özellikleri etkilenmemiş kalır. Ayrıca, bu değiştirilmiş hücreler manyetik hedefleme seçeneği sunuyoruz. Biz burada CD133 modifikasyonu için güvenli ve yüksek verimli bir yordam tarif+ SCs. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) üzerinden yönetilen hücre ürün izleme ve tedavi kök hücre etkileri duruma getirilmesi için standart bir teknoloji sağlamak için bu yaklaşım bekliyoruz.
CD133+ SCs temsil rejeneratif tıp için potansiyel vaat ile bir türdeş olmayan kök ve progenitör hücre nüfus. Onların hematopoetik, endotel ve myogenic farklılaşma potansiyel1,2,3 CD133 sağlar+ hücreleri, neovaskülarizasyon işlemlere farklılaşma yoluyla katkıda bulunmak için Örneğin, yeni gemiler ve pro-anjiogenik parakrin mekanizmaları4,5,6,7tarafından sinyal aktivasyonu içine şekillendirme.
30’dan fazla onaylanmış klinik denemeler (ClinicalTrails.gov) gösterdi yüksek potansiyellerini rağmen tedavi sonuçlarının hala tartışmalı tartışma4altında olması. Nitekim, SCs bir klinik uygulama düşük saklama faiz ve büyük ilk hücre ölüm5,8,9organı tarafından engel oluyor. Ek CD133 mühendislik+ SCs önceki nakli bu zorlukların üstesinden yardımcı olabilir.
Bir etkin hücre tedavisi için bir ön koşul tedavi ilgili hücre10engraftment geliştirmek için büyük ilk hücre ölümü azalma olacaktır. Mevcut çalışmalar ilk 1-2 h sırasında transplante hücre türü bağımsız bir büyük hücre kaybı 90-%99 beyin ve kalp gibi son derece derin organlarında gösterdi veya uygulama rota11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. Manyetik Nano tanecikleri (MNPs) kullanarak SC etiketleme faiz22,23,24,25,26 siteye hedef hücrelere yenilikçi bir non-invaziv strateji sağlar ve aynı anda MRG27 ve Manyetik Parçacık (MPI) Imaging kullanarak hücre izleme sağlar. Uygulanan manyetik hücre hücre rehberlik sonra İntravenöz enjeksiyon23,24,28 yerine yerel yönetim sonra kullanılan hücreye saklama hedefleme en verimli in vivo çalışmalar . Bu nedenle, bizim grup superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri29uncu oluşan bir iletim sistemi tasarlanmıştır. Bu teknik, CD133 ile+ SCs ve insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) verimli hedeflenen, vitro 30,31tarafından gösterildiği gibi çalışır.
SC tedaviler için başka bir engel düşmanca inflamatuar etkilenen doku nakli, ilk hücre ölüm32‘ ye katkıda sonra ortamıdır. Birçok öncesi Klima Araştırma ek olarak, tedavi edici ilgili miRs uygulama test33vardı; başarılı bir şekilde anti-apoptotik miRs apoptosis vitro inhibe ve hücre engraftment vivo içinde33geliştirmek kanıtlanmıştır. 20 – 25 nükleotit oluşan bu küçük moleküller, haberci RNA (mRNA) posttranscriptional modülatörler olarak çok önemli bir rol oynamak ve böylece kök hücre kader ve davranış34etkiler. Ayrıca, miRs eksojen giriş ana bilgisayar genom34istenmeyen istikrarlı entegrasyon kaçının.
Nükleik asitler (NAs) verimli giriş içine birincil SCs için geçerli girişimleri çoğunlukla rekombinant virüs8,35üzerinde temel alır. Yüksek transfection verimlilik rağmen rekombinant virüs manipülasyon bir tezgah başucu çevirisi, Örneğin, kontrol edilemeyen gen ekspresyonu, patojen, immünojenisite ve insertional mutagenesis35 için büyük bir engel sunar. ,36. Bu nedenle, polimer esaslı yapılarını gibi viral teslim sistemleri geliştirmek için önemlidir. Bu arasında polyethylenimine (PEI) miRs bozulması, hücresel alımı, korumak için NA yoğunlaşma gibi sağlayacağı yararlar sunan bir geçerli teslim araç temsil eder ve endosomal aracılığıyla hücre içi yayın kaçış37,38. Ayrıca, miR-PEI kompleksleri yüksek biyouyumluluk klinik39‘ gösterdi. Bu nedenle, bir biotinylated bizim teslimat sistemi oluşur dallı 25 kDa PEI bir streptavidin kaplı MNP çekirdekli30,31,40‘ a bağlı.
Bu makale, biz (i) CD133 el ile izolasyonu açıklayan kapsamlı bir iletişim kuralı mevcut+ SC SC ürün ve (ii) bir verimli ve nazik transfection stratejisi detaylı karakterizasyonu insan kemik iliği (BM) bağış gelen bir manyetik olarak viral polimer tabanlı dağıtım sistemi CD133 genetik mühendisliği için+ SCs miRs kullanarak. CD133+ SCs izole ve manyetik (Mac) sistemi sıralama bir yüzey antikor tabanlı manyetik aktif hücre kullanarak insan sternal BM boğulmadan zenginleştirilmiş. Daha sonra hücre canlılığı hem de hücre saflık akış sitometresi kullanarak analiz edilir. Daha sonra miR/PEI/MNP konut projeleri hazırlanır ve CD133+ SCs transfected. 18 h transfection sonra alımını verimlilik ve transfection SC marker ifade ve hücre canlılığı üzerinde etkisini analiz edilir. Ayrıca, hücre içi dağıtım transfection karmaşık bileşiklerin değerlendirilmesi dört renkli etiketleme ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak gerçekleştirilir.
Son yıllarda, CD133+ SCs ortaya çıktı umut verici bir hücre nüfus olarak birkaç tarafından kanıtlanan SC tabanlı terapiler aşama için ı, II ve III klinik43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ,</s…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma Almanya (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), devlet Mecklenburg-Western Pomerania AB yapısal fonları (ESF/IVWM-B34-0030/10 ve ESF/IVBM-B35-0010/12) ile ve DFG (DA1296/2-1), tarafından desteklenmiştir Alman Kalp Vakfı (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) ve nemli Vakfı. Buna ek olarak, F.H. ve saatleri arasında FORUN Program, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından (889001) desteklenir.
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |