Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Summary

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma’s. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Abstract

Kankercellen hebben routinematig zijn gekweekt in twee dimensies (2D) op een kunststof ondergrond. Deze techniek, mist echter de ware milieu een tumor massa wordt blootgesteld aan in vivo. Solide tumoren groeien niet als verbonden met kunststof blad, maar in plaats daarvan als een verzameling van klonen cellen in een driedimensionale (3D) ruimte interactie met hun buren en met verschillende ruimtelijke eigenschappen zoals de verstoring van de normale cellulaire polariteit. Deze interacties veroorzaken 3D-gekweekte cellen te verwerven van morfologische en cellulaire kenmerken die meer relevant voor in vivo tumoren zijn. Bovendien, een tumor massa is in direct contact met andere celtypes zoals stromale en immuun cellen, evenals de extracellulaire matrix van alle andere celtypes. De matrix gestort bestaat van macromoleculen zoals collageen en fibronectine.

In een poging om de vertaling van de onderzoeksresultaten in Oncologie van bench naar bed, zijn veel groepen begonnen met het gebruik van 3D-modelsystemen in hun drugsstrategieën ontwikkeling onderzoeken. Deze systemen worden verondersteld te zijn meer fysiologisch relevant omdat ze proberen te recapituleren van de complexe en heterogene omgeving van een tumor. Deze systemen, kunnen echter vrij complex en hoewel vatbaar voor groei in 96-Wells-formaten, en sommige nu zelfs in 384, ze weinig mogelijkheden voor grootschalige groei en screening. Dit waargenomen kloof heeft geleid tot de ontwikkeling van de methoden die hier worden beschreven in detail aan cultuur tumor spheroïden in een hoog-productie capaciteit in 1536-Wells-platen. Deze methoden vormen een compromis voor de zeer complexe matrix gebaseerde systemen, die moeilijk op scherm, en conventionele 2D testen. Een verscheidenheid van kanker cellijnen herbergen verschillende genetische mutaties zijn succesvol gescreend, samengestelde werkzaamheid te onderzoeken met behulp van een curator bibliotheek met verbindingen richten de Mitogen-Activated proteïne Kinase of MAPK-pathway. De sferoïde cultuur antwoorden worden dan vergeleken met de reactie van cellen gekweekt in 2D, en differentiële activiteiten worden gemeld. Deze methoden bieden een unieke protocol voor het testen van samengestelde activiteit in een 3D omgeving van hoge gegevensdoorvoer.

Introduction

In het afgelopen decennium hebben meer en meer studies het gebruik van 3D cel cultuur modellen te begrijpen concepten die niet volledig door de groeiende cellen in 2D op plastic zijn gerecapituleerd geïmplementeerd. Voorbeelden van deze concepten zijn de afwisseling in normale epitheliale cel polariteit¹ waar de ruimtelijke oriëntatie van apicale en basale lagen van cellen zijn verloren, evenals de rol van de extracellulaire matrix bij het reguleren van de overleving en het lot van de cel. Oncologie onderzoek, heeft in het bijzonder 3D-modellen gebruikt om te begrijpen van de fundamentele biologie van kankercellen en de verschillen tussen 2D en 3D cel cultuur systemen^3,4. De ontwikkeling van meer geavanceerde cel cultuur technieken en hun verdere aanpassing aan multi goed formaten heeft de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen in 3D instellingen ingeschakeld. In tegenstelling tot cellen gegroeid onder 2D, 3D-modellen van tumoren variëren in complexiteit verschillen van gelaagde cellulaire systemen⁵ tot single-cell-type bollen van verschillende grootte, tot complexe multi-cell-type bollen^{6,7, 8}. de ontdekking van nieuwe verbindingen of biologics die krachtig het induceren van celdood in deze 3D-model-systemen is daarom van groot belang in drug ontwikkeling campagnes. Eindpunten van deze tests zijn vaak identiek zijn aan die uitgevoerd in 2D culturen te beoordelen van wijzigingen in celproliferatie, maar wanneer uitgevoerd in een meer fysiologisch relevante omgeving, zij kunnen openbaren de ware niveau van afhankelijkheid van de target-gen of het traject wordt ondervraagd.

Zoals hierboven geïntroduceerde, allerlei modelsystemen zijn ontwikkeld om te studeren drug reacties in 3D cultuur systemen, maar de meeste gebruiken beide 96 of 384-well microtiterplaat platen en zijn niet gemakkelijk aan te passen aan de high-throughput screening (HTS) formaten vaak gebruikt in Drug discovery screening campagnes. Dergelijke systemen omvatten het gebruik van opknoping druppel technologieën, sferoïde culturen, pulserende cellen met magnetische deeltjes ertoe levitatie, en culturen waarin natuurlijke of synthetische gels zoals collageen, Matrigel of polyethyleenglycol (PEG)² . Hier presenteren we de gedetailleerde methoden van een eerder ontwikkelde techniek om het produceren van 3D sferoïde culturen van gevestigde kanker cellijnen in een formaat van 1536-well plaat. In dit protocol wordt een zeer beschreven medium gebruikt waardoor de bevestiging van normaal aanhangend cel lijnen⁹. Dit systeem heeft beperkingen (dat wil zeggen, het kan niet volledig recapituleren een complex modelsysteem van kanker), maar toch deze testen een high-throughput screening van grote verzamelingen van kleine moleculen en kruiselings vergelijkingen van drug antwoord inschakelen tussen 2D en 3D culturen tegen allerlei soorten cellijnen en verbindingen.

De cellijnen geselecteerd om aan te tonen van de methoden in dit artikel alle harbor mutaties in de genen aan de MAPK weg, een weg die zeer dysregulated in kanker, signalering gerelateerde en voor welke veel therapieën beschikbaar zijn. Veel van de lijnen hebben activeren oncogene mutaties in het Kirsten Rat Sarcoom virus ook wel genoemd de KRAS, de neuroblastoom RAS of NRI’s de Harvey Rat Sarcoom virus oncogen of HRAS en de bijbehorende kinases snel versnelde fibrosarcomen, ook bekend als RAFs. Recente literatuur suggereert dat de inhibitors van verschillende knooppunten van dit traject uniek doeltreffender in een subset van de cellijnen zijn als volwassen onder 3D voorwaarden^9,10. Één studie vond toen kankercellen met actieve RAS werden gekweekt in 3D, dat zij een verhoogde gevoeligheid voor MAPK remmers aangetoond, en verder, dat deze aanpak kon identificeren trajecten en gerichte remmers die zou kunnen worden gemist in de traditionele 2D instelling. Het doel van deze studie is om te presenteren van de methoden die voor de cultuur van deze cellijnen en verder, om aan te tonen het verschil reacties op deze remmers die kunnen worden waargenomen, alleen bij het gebruik van 3D cel cultuur systemen.

Protocol

1. het kweken van 1536-well 3D Tumor spheroïden Voorbereiding van een verse 3D tumor sferoïde middellange stam (cel medium + knock-out serum vervanging insuline-transferrine-selenium) door de volgende reagentia toe te voegen aan 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicilline/streptomycine, 10 ng/mL van de mens fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF), 20 ng/mL van menselijke epidermale groeifactor (EGF), 0,4% bovien serumalbumine (BSA) (deel V), 1 x insuline-transferrine-selenium, en …

Representative Results

Een verscheidenheid van gevestigde kankercel lijnen bekend groeien goed onder 2D kweekomstandigheden werden getest met behulp van de methoden hier. Representatieve beelden uit een verscheidenheid van MAPK mutant kanker cellijnen (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS en KNS-62:HRAS) zijn te zien in Figuur 1. Deze beelden tonen aan dat hoewel de cellijnen verschillende morphologies hebben, elk gevormd 3D structuren in de 1536-well assay-platen. <strong c…

Discussion

De hier gepresenteerde methoden aantonen een gedetailleerd protocol over het produceren van tumor spheroïden in 1536-Wells-platen voor grootschalige samengestelde screenings. Deze methoden zijn in eerste instantie aangepast vanaf werk aan het National Cancer Institute, waar de tumor spheroïden werden geteeld in lage-throughput assays in 6-well en 96-wells-platen om vragen te stellen over genetische afhankelijkheden en samengestelde gevoeligheid^{13, 14 ,</su…}

Materials

Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek