Ammoniakfiberexpansion (AFEX) är en termomkemisk förbehandlingsteknik som kan omvandla lignocellulosisk biomassa (t.ex. majsspis, rishalm och sockerrörspåse) till en lättsmält råvara för både biobränslen och djurfoder. Här beskriver vi en laboratorieskala metod för att genomföra AFEX förbehandling på lignocellulosabiomassa.
Lignocellulosamaterial är vegetabiliska råvaror, såsom restprodukter från grödor (t.ex. majsspis, rishalm och sockerrörssäcksa) och specialodlade energigrödor (t.ex. miscanthus och switchgrass) som finns i stora mängder för att producera biobränslen, biokemikalier och djurfoder. Växtpolysackarider (dvs. cellulosa, hemicellulosa och pektin) inbäddade i cellväggar är mycket motsträviga mot omvandling till användbara produkter. Ammoniakfiberexpansion (AFEX) är en termomkemisk förbehandling som ökar tillgängligheten av polysackarider till enzymer för hydrolys till fermenterbara sockerarter. Dessa frigjorda sockerarter kan omvandlas till bränslen och kemikalier i ett bioraffinaderi. Här beskriver vi en laboratorieskala parti AFEX process för att producera förbehandlad biomassa på gram-skalan utan ammoniak återvinning. Laboratorieskalan kan användas för att identifiera optimala förbehandlingsförhållanden (t.ex. ammoniakbelastning, vattenbelastning, lastning av biomassa, temperatur, tryck, uppehållstid osv.) och genererar tillräckliga mängder förbehandlade prover för detaljerad fysikalisk karakterisering och enzymatisk/mikrobiell analys. Avkastningen av fermenterbart socker från enzymatiska hydrolys av majs stover förbehandlad med hjälp av laboratorieskala AFEX processen är jämförbar med pilotskala AFEX process under liknande förbehandling villkor. Detta dokument är avsett att ge ett detaljerat standardförfarande för säker och konsekvent drift av laboratoriereaktorer för utförande afex förbehandling av lignocellulosabiomassa.
Ammoniak fiber expansion (AFEX) är en termomkemisk förbehandling som använder flyktiga ammoniak som den viktigaste reaktant för cellulosa biomassa förbehandling. Denna process uppfanns ursprungligen av Bruce Dale för att kostnadseffektivt minska motsträvighet av lignocellulosabiomassa och förbättra biologiskt katalyserad förbehandlad biomassa dekonstruktion till fermenterbarasockerarter 1,2. Till skillnad från de flesta andra vattenbaserade termomkemiska förbehandlingar3,AFEX är en torr-till-torr process som inte orsakar någon betydande förändring i biomassa sammansättning och kräver ingen tvätt steg med tillhörande avfall produktion och kostnader. Återvinning av överskott av flyktig ammoniak har påvisats i pilotskalan, vilket har lett till minskade avfallsgenererings- och bearbetningskostnader. Det pilotskalade förpackade reaktorsystemet AFEX som utvecklats av MBI(figur 1)återvinner kvarvarande ammoniak med hjälp av ångstriel och överför den varma, koncentrerade ammoniaken till en ny packad säng4,,5. Efter AFEX förbehandling kan de mindre mängder kväve som ingår i biomassan som kväve som icke-protein kväve av idisslare djur och mikroorganismer. Dessutom, genom att ändra biomassa ultrastruktur genom olika fysikaliska kemiska mekanismer6,7,8, AFEX ökar tillgängligheten av biomassa till kolhydrataktiva enzymer (CAZymes) och ökar andelen polysackarider hydrolys med flera gånger8,9, som också ökar dess smältbarhet av idisslare djur via deras cellulolytiska mikrobiomet4,10,11,12. Jordbrukare har länge använt en enklare version av denna metod för att öka smältbarheten av idisslare foder genom att ruva biomassa i dagar eller veckor under plast presenningar i närvaro av låg vattenfri ammoniak laster (<4% w / w bas av torr biomassa) och omgivande tryck och temperaturer10,11.
Vattenfri ammoniak undersöktes först för sin potential att delignify trä på 1950-talet och som en pulping kemikalie i början av 1970-talet13,14,15,16,17,18. I början av 1980-talet användes först trycksatt, högtemperatur, koncentrerad ammoniak (>30% NH4OH) under subkritiska förhållanden i Dale-laboratoriet för att förbättra den enzymatiska smältbarheten och mikrobiell jäsbarheten hos lignocellulosic biomassa19. Denna process genomgick flera namnändringar under åren, med början som ammoniak frysa explosion, och sedan ammoniak fiber explosion, och slutligen, ammoniak fiber expansion, eller helt enkelt AFEX. Ungefär samtidigt (mitten av slutet av 1980-talet), DuPont (nu Dow-DuPont) utforskas också med hjälp av superkritiska och nästan kritiska vattenfri ammoniak baserade förbehandling processer för att öka smältbarheten av biomassa20,21,22. Under de senaste decennierna har det varit ökad betoning på att använda späd vattenhaltiga ammoniaklösningar som en pretreatment reagens inklusive ammoniak återvinna / perkolation23 (ARP), blötläggning i vattenhaltiga ammoniak (SAA), eller Dow-DuPont processen utan ammoniak återvinna24. Några ytterligare metoder har tittat på användningen av vattenfri ammoniak (låg fukt vattenfri ammoniak (LMAA), och lågflytande ammoniak förbehandling25 (LAA). två nya avancerade organosolv-typ förbehandling teknik som använder flytande vattenfri ammoniak26,,27 och ammoniak-salt baserade lösningar28 vid hög vätska till fasta belastningar har nyligen utvecklats som möjliggör selektiv lignin fraktionering och hög effektivitet enzymatiska hydrolys av förbehandlade cellulosabiomassa vid ultra-låg enzym belastningar. En nyligen genomförd översyn artikel har belyst likheter och distinkta skillnader mellan olika former av ammoniak-baserade förbehandlingar29. Men tills nyligen4, det fanns ingen pilot-skala demonstrationer av ammoniak-baserade förbehandling processer (som AFEX) som var effektivt tillsammans med slutna slinga kemisk återvinning av koncentrerad ammoniak som används i processen.
I detta dokument beskriver vi i detalj det vanligaste AFEX-protokollet för förbehandling av cellulosabiomassa i labbskalan för att producera gramskalor av förbehandlad biomassa (t.ex. 1 till flera 100 g). Vanligtvis blandas biomassa med vatten (0,1–2,0 g H2O/g torr biomassa) och lastas i en specialbyggd reaktor i rostfritt stål eller reaktorer av parrtyp. Vattenfri ammoniak tillsätts sedan (0,3–2,0 g NH3/g torr biomassa) till reaktorn och blandningen värms upp till önskad reaktionstemperatur (60–180 °C). Tidigare publikationer om AFEX-processen från 1980-1990-talet inledde förbehandlingsresidenstiden (t.ex. 5-60 min) omedelbart efter temperaturrampen. Men eftersom reaktionerna inträffar så snart ammoniak läggs till reaktorn, är det nuvarande AFEX-förfarandet att börja övervaka uppehållstiden omedelbart efter ammoniaktillskottet till reaktorn. För temperaturer på 90 °C eller högre är det ofta nödvändigt att förvärma biomassan innan ammoniak lastas för att hålla den ursprungliga temperaturen till en minsta tidsperiod (dvs. <5 min). Vid slutförandet av uppehållstiden öppnas en ventil för att snabbt frigöra trycket och gasfasinnehållet i en lämplig kemisk rökhuv. Den snabba omvandlingen av ammoniak från flytande till gasfas gör också att reaktorn svalnar. Små reaktorer (100 ml reaktorvolym) kan behöva ytterligare tid för att svalna. För användarsäkerhet rekommenderas rensning med kväve i större skala (>100 g ammoniak per reaktorkörning) för att avlägsna så mycket kvarvarande ammoniak som möjligt från kärlet och hjälpa till att kyla reaktorinnehållet före lossning. Vanligtvis görs inga försök på labbet skala att återvinna och / eller återställa ammoniak. En av de viktigaste designutmaningarna för att skala upp AFEX-förbehandlingsprocessen har varit återvinning av ammoniak med minimala kapital- och driftskostnader. Dessutom, lägga flytande ammoniak till biomassa i allmänhet driver partiell blinkande av vätskan som kyler biomassa, kräver uppvärmning av biomassa-ammoniak blandningen innan AFEX behandling kan börja. Hellre än att lägga ammoniak som vätska, lägga ammoniak ånga till biomassa erbjuder två fördelar: För det första, den höga porositet av bulk biomassa tillåter ammoniak ånga som skall transporteras snabbt, vilket resulterar i även ammoniak distribution i hela biomassa. För det andra löser ammoniakånga lätt och exotermt upp i vattnet som är intränat i fuktig biomassa, vilket resulterar i värmegenerering som snabbt och jämnt värmer biomassan. För att utnyttja dessa fördelar har både MSU Dale lab och MBI utvecklat AFEX behandlingsmetoder med hjälp av ammoniakånga. Dale labbet har utvecklat Gaseous Ammoniak Pretreatment (GAP) process30, och MBI har utvecklat den packade sängen AFEX reaktorprocessen (figur 1)4, som har visats på pilotskalan. Det förpackade reaktorsystemet AFEX kan delvis i satsläge drift med fullständig återvinning av ammoniak med hjälp av en ångstripningsmetod4,5. Denna nya MBI pilot-skala process utnyttjar de kemiska och fysiska egenskaperna hos ammoniak för att effektivt förbehandla biomassa samtidigt effektivt återvinning av ammoniak.
Här presenterar vi en detaljerad översikt för att genomföra AFEX förbehandling av majs stover på labbet skala med specialbyggda 200 ml volym rörformiga reaktorer(figur 2). AFEX förbehandlade prover röts till fermenterbart socker med kommersiellt tillgängliga cellulolytiska enzym cocktails för att visa effekten av förbehandling processer. De enzymatiska hydrolysresultaten för den labskala AFEX-reaktorn jämfördes med stora AFEX-reaktorgenererade prover i pilotskala. Vårt mål är att tillhandahålla ett standardförfarande för säker och konsekvent drift av lab-skala trycksatta reaktorer för att utföra AFEX förbehandling på cellulosabiomassa som majs stover. Ytterligare stödjande information om variationer i denna lab-skala AFEX förbehandling process (t.ex. pilot-skala packade säng AFEX process) är ytterligare markerade i den medföljande kompletterande pdf-filen. En detaljerad rapport om den packade sängen AFEX processen operativa steg kommer att belysas i en separat publikation och finns tillgänglig på begäran från MBI-MSU.
AFEX-protokollet beskriver hur man bearbetar växtmaterial i närvaro av vattenfri ammoniak och vatten vid förhöjda temperaturer för att öka förbehandlingsmaterialets smältbarhet genom cellulolytiska enzymer och/eller mikrober. AFEX är mycket effektiv på graminoid monocot arter (t.ex. majs stover, switchgrass, miscanthus, ris halm, vete halm, och sockerrör bagasse) på grund av effektiviteten i processen att klyva ester kopplingar som är naturligt rikligt i dessa material31. AFEX är mycket mindre effektiv på biomassa som härrör från dicots och gymnosperms (lövträd, barrträd, och inhemska forbs)32,33 på grund av den mindre andelen lignin-kolhydratbaserade ester kopplingar. Men när dessa kopplingar införs i woody cell väggar med hjälp av växt bioteknik, afex förbehandling processen blir mycket effektivare34.
Klyvning av ester kopplingar tillåter vissa biomassa komponenter som skall tas bort från materialet, men redeposited som extraktiva på den yttre cellväggen ytor, vilket resulterar i bildandet av nanoskala hål som underlättar penetration och verkan av cellulolytiska enzymer6. AFEX förbehandlade majs stover visade en ungefär 3-faldig ökning av glukos och xylose release takt efter enzymatiska hydrolys under höga fasta förhållanden jämfört med obehandlat material. Ammoniak förbehandlingar producerar också färre och mycket mindre hämmande nedbrytningsprodukter jämfört med utspädd syra förbehandling35. En tidigare jämförelse av AFEX och späd syrabehandlad majs stover visade att utspädd syra förbehandling producerar 316% fler syror, 142% mer aromater, och 3.555% mer furan aldehyder än AFEX36, som alla kan hämma för mikroorganismer35,,37. Eftersom AFEX är en torrtorr process, det finns inte heller någon förlust av socker som en utspädd flytande ström som inte ekonomiskt kan utnyttjas under enzymatisk hydrolys. Detta leder dock till komplikationer som enzymer med både cellulosa-nedbrytbara och hemicellulosa-nedbrytning förmåga krävs för att helt bryta ner cellväggen polysackarider under enzymatisk hydrolys i blandade fermenterbara sockerarter som glukos och xylose. Hemicellulosic oligomers har rapporterats hämma cellulase verksamhet38, vilket kan kräva en högre enzym belastning för att upprätthålla en hög slutlig socker avkastning. Optimering av lämpliga enzymcocktails kan dock minska den totala enzymanvändningen vid sackarifiering av AFEX förbehandlad biomassa39,40,,41,,42,43,44,45., Under AFEX förbehandlingsprocess leder hydrolys och ammonolys av esterkopplingar till bildandet av syra och blandprodukter i den förbehandlade biomassan (t.ex. ättiksyra/ acetamid, ferulinsyra/ferulamid, kumarinsyra/koumumarylamid)36. Även bildandet av amider har visat sig hjälpa jäsningsprocessen, deras närvaro vid mycket höga koncentrationer i förbehandlade råvaror kan vara ett problem om utfodring djur förbehandlade biomas. Prehydrolys av ester kopplingar med alkali som NaOH eller Ca (OH)2 före AFEX förbehandling kan användas för att lösa problemet.
Det finns ett antal säkerhetsaspekter att tänka på när man arbetar med vattenfri ammoniak under AFEX-processen. Vattenfri ammoniak reagerar med koppar, mässing, aluminium, kolstål och vanliga fluorelastomerpolymerer som används i tätningar (t.ex. Slangar eller reaktorkomponenter som kan komma i kontakt med ammoniak bör vara tillverkade av rostfritt stål, och packningar, ventilsäten och snabbkopplingstätningar bör göras från Teflon eller Kalrez när det är möjligt. Ammoniak anses inte vara en giftig kemikalie, men det är fortfarande farligt på grund av dess hygroskopiska och kryogena egenskaper. Det riktar sig lätt och kan allvarligt skada slemhinnor i ögon och andningsorganen. Ammoniak är en kryogen vätska och ammoniakläckor kan orsaka svåra köldskador på grund av direkt kontakt med gasströmmen eller kyld utrustning. Ammoniak är omedelbart farligt för liv och hälsa (IDLH) vid koncentrationer över 300 ppm. Arbetstagare bör evakuera omedelbart i händelse av att koncentrationen överstiger 50 ppm. Det rekommenderas att operatörerna bär en kalibrerad ammoniakmonitor för att varna för farliga koncentrationer i deras närhet. Det är också tillrådligt att installera sensorer med larm i huvudarbetsområdet. Arbetstagare som hanterar ammoniak bör vara ordentligt utbildade och bära skyddsutrustning såsom utrymningsskyddsvägar utrustade med metylaminpatroner och kryogena och värmeskyddande handskar, och vara beredda att hantera nödsituationer. Vid exponering för vattenfri ammoniak bör operatören röra sig i säkerhet och omedelbart spola det drabbade området med vatten i minst 15 minuter. Ammoniakförbehandlingsprocessen bör utföras inuti en rökhuva, och ammoniakcylindern ska antingen förvaras i en rökhuva eller ventilerat skåp. Efter experimentet kommer förbehandlad biomassa att ha en del restfri ammoniak och bör antingen torkas i huven över natten eller i en anpassad ventilerad torkbox före förvaring i plastpåsar vid rumstemperatur för uppföljande experiment. Några andra viktiga säkerhetsöverväganden är installation av ett ammoniakleveranssystem med en flödesmätare som hjälper till att exakt leverera ammoniak till reaktorn och en reaktor som är konstruerad för att hantera minst 1,5 gånger det tryck som förbehandlingsprocessen kommer att genomgå (t.ex. för hantering av AFEX-processen vid 2 x 106 Pa-tryck, bör lägsta tryckklassning av reaktorn vara 3 x 106 Pa).
AFEX förbehandling är en lovande metod för att producera mycket lättsmält växtbiomassa som kan användas direkt som djurfoder eller som råvara för att generera bränslen och kemikalier. Utöver dessa två industrier kan AFEX komma att användas på andra områden, såsom en biodyrbar råvara för att tillverka biomaterial, eller som råvara för produktion av biogas. Laboratorieskalaprocessen kan utföras i ett laboratorium utrustat med lämpligt ventilerat utrymme och säkerhetsåtgärder, och vårt nuvarande arbete bekräftar att denna nedskalade AFEX-process visar liknande resultat som material som genereras i en skalad och/eller pilot-AFEX-reaktor. Den lab-skala AFEX processen kan användas för att testa råvaror, bearbetningsförhållanden och applikationer på ett högre genomströmning sätt, samtidigt som en rimlig förväntan om hur processen skulle fungera på pilot- eller industriella skalor.
The authors have nothing to disclose.
Detta material är baserat på arbete som delvis stöds av Great Lakes Bioenergy Research Center, US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research under Award Numbers DE-SC0018409 och DE-FC02-07ER64494. Rebecca Ong erkänner delvis stöd från Michigan Technological University (startup finansiering). Shishir Chundawat erkänner delvis stöd från US National Science Foundation CBET award (1604421), ORAU Ralph E. Powe Award och Rutgers School of Engineering (Startup Funding). Bruce Dale erkänner delvis stöd från Michigan State University AgBioResearch kontor och även USDA National Institute of Food and Agriculture. Venkatesh Balan erkänner delvis stöd från delstaten Texas och University of Houston (Startup Finansiering). MBI anställda erkänner delvis stöd från US Department of Energy och Michigan State University stiftelse. Slutligen vill vi ägna detta dokument till vår mentor och medförfattare Prof. Bruce Dale för att inspirera oss att tillsammans fullfölja vår dröm om att göra hållbara cellulosa biobränslen.
Safety Equipment/PPE | |||
Ammonia Monitor | CanarySense | BW GAXT-A-DL | Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm |
Cryogenic gloves | Amazon | B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 | Keep hands protected when handling liquid ammonia |
Ear muffs | 3M | H7A | Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment |
Face shield | – | – | Wear while handling ammonia |
Heat protective gloves | Grainger | 2EWX1/2EWX2/2EWX3 | Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F |
Nitrile gloves | – | – | Wear while mixing biomass to prevent contamination |
Reagents | |||
Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder | – | – | An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder. |
Distilled water | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
Milled or Chopped Corn Stover | – | – | Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some. |
Nitrogen Compressed Gas Cylinder | – | – | |
Equipment | |||
Ammonia Cylinder Adapter | – | – | CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia. |
Ammonia Delivery System (Figure 4) | Swagelok | Misc. | Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia. |
Analytical Balance | Sartorius | CPA4202S | Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g |
Chemraz O-rings | Harvard Apparatus | 5013091 | Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe |
Custom Tubular Reactors (Figure 3) | Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) | Misc. | To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps. |
Drying Box | – | – | Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures. |
High Pressure Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3311 | Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia |
Moisture Analyzer | Sartorius | MA35 | Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment. |
Nitrogen Delivery | Misc. | Misc. | Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves. |
Ratchet wrench and 7/8" socket | – | – | Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere. |
Retractable Thermocouple Cables | Omega | RSC-K-3-4-5 | Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor. |
Stainless Steel Syringe | Harvard Apparatus | 702261 | Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors. |
Temperature Monitor | Omega | HH12B | Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors. |
Voltage Controller | McMaster-Carr | 6994K11 | Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor. |
Supplies | |||
Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas | – | – | For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run |
Plastic Bowls or Tubs | – | – | Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used. |
Spray Bottle | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
Wide-Mouth Funnel | – | – | Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter. |
Wooden Dowel | – | – | 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor |
Consumables | |||
Glass Wool | Sigma-Aldrich | CLS3950-454G | For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing |
Plastic Press-to-Close Bags | McMaster-Carr | 1959T24 | Bags for storing processed samples and for transferring to drying box |
Plastic Tote | – | – | Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying |
Plastic Weighboats or Metal Trays | – | – | Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying |