Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

Summary

Nous présentons ici la projection préclinique des coumarines anticancéreux à l’aide de poisson-zèbre et la culture 3D.

Abstract

Projection pré-cliniques in vitro et in vivo de nouveaux agents thérapeutiques sont un outil essentiel dans la découverte de médicaments du cancer. Bien que les lignées cellulaires cancéreuses humaines répondent à des composés thérapeutiques en culture cellulaire monocouche (dimensionnelle) 2D, systèmes de culture 3D ont été développés pour comprendre l’efficacité des médicaments dans des modèles plus physiologiquement pertinents. Ces dernières années, un changement de paradigme a été observé dans la recherche préclinique pour valider l’efficacité de nouvelles molécules dans les systèmes de culture 3D, plus précisément imitant le microenvironnement tumoral. Ces systèmes de caractérisent l’état de la maladie d’une manière plus physiologiquement pertinente et aident à gagner mieux mécaniste perspicacité et la compréhension de l’activité pharmacologique d’une molécule donnée. En outre, avec la tendance actuelle dans l’amélioration des modèles de cancer en vivo , poisson zèbre est devenue un important modèle de vertébrés pour évaluer in vivo la formation de tumeurs et d’étudier l’effet des agents thérapeutiques. Ici, nous avons étudié l’efficacité thérapeutique de hydroxycoumarine OT48 seul ou en combinaison avec BH3 mimétiques dans la lignée de cellules cancéreuses du poumon A549 à l’aide de trois systèmes de culture 3D différente, y compris les essais de formation de colonie (CFA), essai de formation sphéroïde (SFA) et en vivo zebrafish xénogreffes.

Introduction

Le cancer est causé par des mutations cellulaires et par conséquent les voies biochimiques de signalisation sont perturbées déclenchant la division cellulaire incontrôlée et la résistance à la mort cellulaire. Les tumeurs interfèrent avec les fonctions physiologiques de l’appareil digestif, nerveux, circulatoire et par la suite voisine tissus¹. Malgré les efforts de recherches approfondies, le cancer reste la maladie mortelle la plus répandue dans le monde². Médecine de précision a été reconnue comme la Fondation de l’avenir thérapeutique anticancéreuse. Nouvelles entités moléculaires sont systématiquement testées en ass....

Protocol

1. colonie Formation essais

1. Cellulaire de cellules A549 culture à une concentration de 20 000 cellules/cm² dans 15 mL de RPMI1640 milieu de culture enrichi avec 10 % SVF (sérum de veau fœtal) et 1 % antibiotiques dans une fiole de² 75 cm dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C et 5 % de CO₂.
2. Le jour de l’expérience, déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Recueillir 50 000 cellules par centrifugation à 400 g pendant 7 min dans un tube de microtubes de 1,5 mL et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de 1 x solution PBS stérile (Phosphate Buffered Saline) dans des ....

Results

Dans la Figure 2, le cancer du poumon cellules ligne A549 a été ensemencé dans MCBM à former des colonies après le traitement avec OT48 seul ou en combinaison avec BH3 A1210477 mimétique aux concentrations indiquées. Les résultats ont montré que la combinaison significativement réduit nombre, la taille et la surface totale des colonies, après 10 jours d’incubation.

Dans la Figur.......

Discussion

Les tarifs de la formation de colonies obtenues avec MCBM dépend du type de cellule. Généralement, pour les cellules non adhérentes, le nombre de colonies est beaucoup plus élevé par rapport aux cellules adhérentes. Nous avons observé que les cellules A549 forment des colonies de 30 à 40 après 10 jours. Précédemment, nous avons rapporté des cellules leucémiques différents que le nombre de colonies est entre 200 et 250⁹. Nos résultats ont montré que OT48 seul n’a pas produit une diminution signific.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matériaux nécessaires aux essais de formation de colonies
A549	ATCC	CCL-185	37 C° ;
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C° ;
FBS	Biowest	S1520-500-20	C° ;
Pénicilline-Streptomycine	Lonza	17-602E-20	C° ;
Fiole de culture cellulaire T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Tube de 1,5 ml		Extragene Tube-170-C	Tube de
15 ml	Hyundai Micro	H20015	RT
12 plaque de puits	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell technologies	4230-20	C° ;
Bromure de tétrazolium bleu de thiazolyle (poudre MTT)	Sigma	M5622	4 C° ;
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
strong>Matériaux requis pour le dosage de la formation de sphéroïdes
A549	ATCC	CCL-185	37 C° ;
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C° ;
FBS	Biowest	S1520-500-20	C° ;
Pénicilline-streptomycine	Lonza	17-602E-20	C° ;
Fiole de culture cellulaire T75	SPL	70075	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsine-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C° ;
Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate	Corning	3474	RT
Microscopie	Nikon	Eclipse TS100	RT
Matériaux requis pour les xénogreffes de poisson-zèbre
A549	ATCC	CCL-185	37 C° ;
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C° ;
FBS	Biowest	S1520-500-20	C° ;
Pénicilline-streptomycine	Lonza	17-602E-20	C° ;
Fiole de culture cellulaire T25	SPL	70025	RT
Fiole de culture cellulaire T75	SPL	70075	RT
Fiole de culture cellulaire T175	SPL	71175	RT
Tube de 1,5 ml		Extragene Tube-170-C	RT
24 plaque de puits	SPL	30024	RT
Pétridish	SPL	10100	RT
PBS solution	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsine-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C° ;
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	71382	RT
Chlorure de potassium (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
Nitrate de calcium tétrahydraté (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	RT
Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate (Tricaïne)	Sigma-Aldrich	E10521	RT
Solution de rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P0290	RT
Méthylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	RT
1-phényl-2-thiourée (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	RT
CM-Dil colorant	Invitrogen	C7001-20	C° ;
Capillaire en verre	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Extracteur de micropipette	Instrument à obturateur, États-Unis	P-97	RT
Micro-injecteur	World Precision Instruments	PV820	RT
Seringue	KOVAX	1ml	RT
Micro chargeur	Eppendorf	5242956003	RT
Lame en verre	Marienfeld	HSU-1000612	RT
Microscopie à fluorescence	Leica	DE/DM 5000B	RT