यहाँ हम मानव नाक उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी अंडाकार आकृति संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन. Spheroids तो सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक (CFTR) ड्राइव करने के लिए उत्तेजित कर रहे हैं-निर्भर आयन और द्रव स्राव, CFTR समारोह के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में अंडाकार आकृति चमकदार आकार में परिवर्तन को बढ़ाता है.
जबकि सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक की शुरूआत (CFTR) मॉडुलन दवाओं सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), जीनोटाइप-निर्देशित चिकित्सा मॉडल वर्तमान में उपयोग में कई सीमाएं हैं में क्रांति की देखभाल की है । पहले, दुर्लभ या अध्ययन उत्परिवर्तन समूहों निश्चित नैदानिक परीक्षणों से बाहर रखा गया है । इसके अलावा, अतिरिक्त मॉडुलन दवाओं के रूप में बाजार में प्रवेश, यह एक व्यक्ति विषय के लिए मॉडुलन विकल्प का अनुकूलन करने के लिए मुश्किल हो जाएगा. इन मुद्दों के दोनों रोगी के उपयोग के साथ संबोधित कर रहे हैं, व्युत्पंन CFTR समारोह और मॉडुलन के व्यक्तिगत नैदानिक मॉडल प्रणालियों । मानव नाक उपकला कोशिकाओं (HNEs) इस तरह के एक मॉडल के लिए श्वसन ऊतक के एक आसानी से सुलभ स्रोत हैं. इस के साथ साथ, हम CFTR समारोह और मॉडुलन प्राथमिक HNEs का उपयोग कर के एक तीन आयामी अंडाकार आकृति मॉडल की पीढ़ी का वर्णन । HNEs एक न्यूनतम इनवेसिव फैशन में विषयों से अलग कर रहे हैं, सशर्त reprogramming शर्तों में विस्तारित, और अंडाकार आकृति संस्कृति में वरीयता प्राप्त । बोने के 2 सप्ताह के भीतर, अंडाकार आकृति संस्कृतियों HNE spheroids कि 3 ‘ के साथ उत्तेजित किया जा सकता है उत्पंन, 5 ‘ चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर)-एगोनिस्ट समारोह को सक्रिय करने CFTR पैदा । अंडाकार आकृति सूजन तो CFTR गतिविधि के एक प्रॉक्सी के रूप में quantified है । HNE spheroids नाक कोशिकाओं के ंयूनतम इनवेसिव, अभी तक श्वसन मूल पर कैपिटल के लिए एक सुलभ, व्यक्तिगत एक उपकला रोग रुग्णता और मृत्यु दर को प्रतिबिंबित करने के लिए प्रासंगिक मॉडल उत्पंन करने के लिए । वायु तरल अंतरफलक HNE संस्कृतियों की तुलना में, spheroids अपेक्षाकृत परिपक्व है, जो समग्र संदूषण दर को कम कर देता है जल्दी कर रहे हैं । अपने मौजूदा रूप में, मॉडल कम प्रवाह द्वारा सीमित है, हालांकि इस ऊतक अधिग्रहण के सापेक्ष आसानी से भरपाई है । HNE spheroids के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मज़बूती से मात्रा और व्यक्तिगत स्तर पर CFTR गतिविधि की विशेषता । एक निरंतर अध्ययन करने के लिए इस ठहराव टाई करने के लिए vivo दवा प्रतिक्रिया में अगर HNE spheroids CFTR मॉडुलन करने के लिए रोगी प्रतिक्रिया के एक सच्चे पूर्व नैदानिक कारक हैं निर्धारित करेगा.
सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) एक घातक, autosomal अवकाश ७०,००० लोगों को दुनिया भर में1से अधिक प्रभावित रोग है । यह जीवन-छोटा आनुवंशिक रोग सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक प्रोटीन (CFTR)2में उत्परिवर्तनों के कारण होता है । CFTR adenosine ट्राइफॉस्फेट-बाध्यकारी कैसेट परिवार के एक सदस्य है, और एक आयन क्लोराइड के आंदोलन की अनुमति चैनल के रूप में कार्य करता है और जठरांत्र संबंधी मार्ग सहित कई ध्रुवीय शिखर के epithelia झिल्ली में बिकारबोनिट, पसीने की ग्रंथि, और श्वसन पेड़, दूसरों के बीच3,4। इस तरह के रूप में, बेकार CFTR multisystem उपकला रोग की ओर जाता है, सबसे मृत्यु के साथ श्वसन रोग1से उपजी. CF फेफड़ों में, CFTR चालित airway सतह तरल (ASL) विनियमन और बलगम रिहाई की हानि और अधिक मोटा होना बलगम की ओर जाता है, airway रुकावट, जीर्ण संक्रमण, और प्रगतिशील airway remodeling और फेफड़ों के समारोह के नुकसान1,5.
रोग के कारण के रूप में CFTR रोग की पहचान के बावजूद, CF में चिकित्सा पारंपरिक रूप से लक्षणों के शमन पर ध्यान केंद्रित (जैसे, अग्नाशय एंजाइम रिप्लेसमेंट थेरेपी, airway निकासी चिकित्सा)1. इस दृष्टिकोण हाल ही में उपंयास चिकित्सकीय के आगमन से क्रांति की थी, “CFTR मॉडुलन,” कि सीधे बेकार CFTR लक्ष्य । इस दृष्टिकोण से नैदानिक परिदृश्य लक्षण प्रबंधन से रोग-संशोधित देखभाल करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है, लेकिन कई सीमाएं6,7,8,9,10वहन करती है । मॉडुलन गतिविधि प्रत्येक CFTR उत्परिवर्तन के साथ प्रोटीन दोष के लिए विशिष्ट है और आनुवंशिक आबादी11का चयन करने के लिए सीमित. इस सीमा प्रोटीन दोषों की विषम प्रकृति से प्रेरित है, लेकिन यह भी दुर्लभ उत्परिवर्तन समूहों में नैदानिक परीक्षणों की अव्यावहारिकता से । इसके अलावा, अच्छी तरह से अध्ययन पादी के साथ विषयों के बीच (जैसे, F508del/F508del CFTR, सबसे आम CFTR उत्परिवर्तन), वहां रोग के बोझ में व्यापक परिवर्तनशीलता है और मॉडुलन प्रतिक्रिया6,7,8 ,9,11.
इन दोनों मुद्दों को दूर करने के लिए जांचकर्ताओं ने12नैदानिक परीक्षण के लिए वैयक्तिकृत मॉडलों के उपयोग का प्रस्ताव किया है । इस अवधारणा को एक व्यक्तिगत फैशन में उपचार के लिए vivo विषय प्रतिक्रिया में भविष्यवाणी, यौगिक परीक्षण के लिए एक अलग पूर्व vivo मॉडल प्रणाली उत्पन्न करने के लिए रोगी-विशिष्ट ऊतक का उपयोग करता है । एक बार पुष्टि की, इस तरह के एक मॉडल चिकित्सकों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है परिशुद्धता थेरेपी रोगी के अंतर्निहित CFTR जीनोटाइप की परवाह किए बिना ड्राइव ।
मानव दमा उपकला (HBE) फेफड़ों प्रत्यारोपण के समय explant ऊतक से प्राप्त कोशिकाओं CF13,14के लिए इस तरह के एक मॉडल की संभावना स्थापित. HBEs एक हवाई तरल इंटरफेस (अली) में उगाया electrophysiologic परीक्षण या परोक्ष ASL homeostasis13,15के उपायों के माध्यम से सीधे के माध्यम से कार्यात्मक CFTR ठहराव के लिए अनुमति देते हैं । यह मॉडल CFTR जीवविज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहा है और CFTR ढा16के विकास में एक महत्वपूर्ण चालक था । दुर्भाग्य से, HBE मॉडल अधिग्रहण के इनवेसिव प्रकृति (फेफड़े प्रत्यारोपण या दमा ब्रशिंग) और दुर्लभ उत्परिवर्तन या हल्के रोग के साथ उन लोगों के लिए नमूनों की कमी के कारण एक व्यक्तिगत मॉडल के रूप में तर्कसंगत नहीं कर रहे हैं । इसके विपरीत, आंतों के ऊतकों, मलाशय या ग्रहणी बायोप्सी नमूनों से प्राप्त, आंतों वर्तमान माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (आईसीएम) या एक सूजन-आधारित organoid परख व्यक्तिगत CFTR समारोह का अध्ययन करने के लिए17,18, 19. Organoid परख, विशेष रूप से, CFTR गतिविधि20,21,22के बहुत संवेदनशील मॉडल हैं । दोनों मॉडलों ऊतक स्रोत द्वारा सीमित कर रहे है (आंत्र ऊतक, जबकि सबसे रोग विकृति श्वसन है) और अधिग्रहण के अर्द्ध इनवेसिव विधि । वैकल्पिक रूप से, कई जांचकर्ताओं मॉडल CFTR बहाली23,24,25के लिए मानव नाक उपकला (HNE) कोशिकाओं का अध्ययन किया है । HNEs सुरक्षित रूप से किसी भी उंर के विषयों में ब्रश या curettage द्वारा काटा जा सकता है और, जब अली में संस्कृति, दोहराऊंगा के कई लक्षण HBEs25,26,27,28। HNE monolayer संस्कृतियों परंपरागत रूप से स्क्वैमस परिवर्तन और एक लंबे समय के लिए29परिपक्वता के द्वारा सीमित किया गया है । इसके अलावा, HNEs में कम सर्किट वर्तमान माप की सूचना HBEs में उन लोगों की तुलना में छोटे हैं, एक छोटी खिड़की का पता लगाने के लिए चिकित्सीय प्रभावकारिता25।
एक व्यक्तिगत, गैर इनवेसिव, श्वसन CFTR समारोह के ऊतक संस्कृति मॉडल के लिए की जरूरत को देखते हुए, हम एक सूजन आधारित, गैर इनवेसिव और HNEs के श्वसन प्रकृति के साथ organoid परख की संवेदनशीलता विलय की मांग की । यहां, हम 3 पैदा करने की हमारी विधि का वर्णन आयामी “अंडाकार आकृति” एक सूजन में व्यक्तिगत CFTR अध्ययन के लिए HNEs की संस्कृतियों-परख 30 आधारित है । HNE spheroids क्षेत्र केंद्र, या लुमेन की ओर उपकला शीर्ष के साथ मज़बूती से ध्रुवीकरण. यह मॉडल एक कम श्वसन उपकला के कई लक्षण recapitulates और अधिक जल्दी से अली संस्कृतियों की तुलना में परिपक्व होता है । एक कार्यात्मक परख के रूप में, HNE spheroids मज़बूती से CFTR समारोह की एक सीमा है, साथ ही अच्छी तरह से अध्ययन उत्परिवर्तन समूहों में मॉडुलन (जैसे, F508del CFTR) मात्रा । यह सूजन के आधार पर परख आयन/CFTR के नमक परिवहन गुण, परोक्ष रूप से अंडाकार आकृति में तरल पदार्थ का तांता मापने के रूप में पानी शिखर नमक समाप्ति के बाद । इस फैशन में, पूरी तरह कार्यात्मक CFTR के साथ उत्तेजित spheroids मजबूती से प्रफुल्लित है, जबकि बेकार CFTR के साथ उन कम या हटना प्रफुल्लित । यह पूर्व के छवि विश्लेषण के माध्यम से quantified है और 1 एच पद उत्तेजना spheroids, चमकदार क्षेत्र को मापने और प्रतिशत परिवर्तन का निर्धारण । इस उपाय तो प्रयोगात्मक समूहों में एक रोगी विशेष फैशन में दवा के लिए गैर-गतिविधि के लिए स्क्रीन की तुलना में किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल रोगी की पीढ़ी नाक सेल अंडाकार आकृति एक व्यक्तिगत, CFTR समारोह के विशिष्ट मॉडल का उत्पादन करने में सक्षम संस्कृतियों का वर्णन करता है । इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम है कि बारीकी से कठिन?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन चिकित्सकीय, अनुदान संख्या CLANCY14XX0 द्वारा समर्थित किया गया था, और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन के माध्यम से, अनुदान संख्या CLANCY15R0. लेखक रोगी भर्ती और विनियामक निरीक्षण में उसकी सहायता के लिए क्रिस्टीना रे शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । लेखक भी HNE कार्य समूह, सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन, जो HNE संस्कृति क्षमताओं की पीढ़ी में सहायता: प्रेस्टन Bratcher, केल्विन कॉटन, मार्टिना Gentzsch, एलिजाबेथ Joseloff, माइकल Myerburg, डेव Nichols, द्वारा समर्थित का शुक्रिया अदा करना चाहता हूं स्कॉट Randell, स्टीव रोवे, जी मार्टी सुलैमान, और कैथरीन Tuggle ।
1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |