Her presenterer vi en robust og optimalisert protokoll for produksjon av mg mengder innfødt, koden-ledig monomerer og fibrils av exon1 av Huntingtin protein (Httex1) basert på forbigående fusjon av små ubiquitin relaterte modifikator (SUMO).
Huntingtons sykdom (HD) er en arvelig dødelig nevrodegenerative sykdommer forårsaket av en CAG ekspansjon (≥36) i den første ekson av HD genet, gir uttrykk for Huntingtin protein (Htt) eller N-terminal fragmenter av med en utvidet polyglutamine ( polyQ) strekk.
Exon1 av Huntingtin protein (Httex1) er det minste Htt fragmentet som viser mange av funksjonene i HD i mobilnettet og dyr modeller og er en av de mest studerte fragmentene av Htt. Den lille størrelsen på Httex1 gjør det eksperimentelt mer mottakelig for Biofysiske karakterisering ved hjelp av standard og høy oppløsning teknikker i forhold til lengre fragmenter eller full lengde Htt. Men har høy aggregering tilbøyelighet av mutant Httex1 (mHttex1) med økt polyQ innhold (≥42) gjort det vanskelig å utvikle effektive uttrykk og rensing systemer for å produsere disse proteinene i tilstrekkelige mengder og gjøre dem tilgjengelig for forskere fra ulike disipliner uten bruk av fusion proteiner eller andre strategier som forandre innfødt sekvensen av protein. Vi presenterer her en robust og optimalisert metode for produksjon av mg mengder innfødt, koden-ledig Httex1 basert på forbigående fusjon av små ubiquitin relaterte modifikator (SUMO). Enkelhet og effektivitet av strategien vil eliminere behovet for å bruke ikke-native sekvenser av Httex1, dermed gjør dette proteinet mer tilgjengelig for forskere og forbedre reproduserbarhet eksperimenter over forskjellige laboratorier. Vi tror at disse fremskritt vil også lette fremtidige studier Klargjørende struktur-funksjon forholdet mellom Htt samt utvikle nye diagnostiske verktøy og terapi for å behandle eller langsom progresjonen av HD.
Htt er et 348 kDa protein, og har vært innblandet i flere fysiologiske funksjoner1. Når Htt inneholder en utvidet polyQ region i mer enn 36 rester i sin N-terminus, fører det til HD2,3. HD patologi er preget av mobilnettet Inneslutninger i striatum og cortex, som fører til nevronale død og atrofi av berørte vev4,5. Flere N-terminal Htt fragmenter som inneholder den polyQ gjentatte tarmkanalen påvist i obduksjon hjernen fra HD pasienter og antas genereres av proteolytisk behandling av huntingtin protein6. Nyere studier tyder på at Httex1 kan også dannes på grunn av avvikende mRNA skjøting. Httex1 inneholder patologisk polyQ mutasjon, og dens overuttrykte i dyr kan recapitulate mange av de viktigste funksjonene i HD7, utheving dermed en mulig sentral rolle i denne fragment i HD patologi og sykdom progresjon6, 8,9.
På grunn av høy aggregering tilbøyelighet av mutant Httex1 (mHttex1) med utvidet polyQ skrift, fleste eksisterende uttrykk systemer er basert på forbigående fusjon av Httex1 proteiner (for eksempel glutathione-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) eller maltose-binding-protein (MBP) og/eller peptider (poly-histidin) som ulikt forbedre sitt uttrykk, stabilitet, rensing eller løselighet10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,,24,,25,,26,,27,,28. Fusion partneren er koblet til Httex1 med en kort sekvens som inneholder en cleavage nettsted for proteaser som trypsin, tobakk etse virus (TEV) protease eller PreScission for cleavage og utgivelsen av Httex1 før oppstart av aggregering eller rensing. Mangler disse metodene omfatter muligheten for ytterligere rester på grunn av ikke-traceless cleavage og etableringen av avkortet på grunn av miscleavage i en rekke Httex1, i tillegg til heterogenitet skyldes ufullstendig cleavage ( se Vieweg et al. for mer dyptgående diskusjon om fordeler og begrensninger av denne tilnærmingen)10. For å løse disse begrensningene, utviklet vi nylig en uttrykk strategi aktiverer generering av kode-free opprinnelige Httex1 for første gang ved å benytte en forbigående N-terminal blanding av Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein Httex110. Mens intein cleavage er traceless og bestemt og gir mg mengde proteiner, det fortsatt lider to ulemper kan redusere avkastningen: nemlig tidlig spalting av intein som kan oppstå under uttrykket, og det faktum at cleavage skjer over flere timer, som kan føre til tap av protein på grunn av aggregering, spesielt for Httex1 med utvidet polyQ gjentas.
Håndtere disse begrensningene og fornye vår strategi for produksjon av innfødte, koden-ledig Httex1, vi utviklet et nytt uttrykk system basert på forbigående fusjon av SUMO, mer nøyaktig den gjær homolog Smt3 til Httex1. Bruk av SUMO systemet for produksjon av rekombinante proteinene ble først publisert i 200429, hvor økt hastighet på uttrykk og løslighet SUMO fusion protein ble demonstrert. SUMO koden kan være kløyvde av ubiquitin som protein-spesifikke protease 1 (ULP1), som ikke krever en anerkjennelse webområdet, men gjenkjenner tertiær strukturen i SUMO og praktisk talt eliminerer muligheten av miscleavage30. Videre ULP1-mediert cleavage er rask og traceless og la ikke ekstra rester. I tidlig spalting av fusion koden, unngås som observert med autocatalytic intein10, helt av kravet om en ekstern protease. Mens SUMO strategien er nå mye brukt for rekombinante proteiner produksjon31,32,33, viser vi i dette papiret at det er spesielt nyttig for generering av en egentlig uordnede, aggregering utsatt, amyloidogenic protein som Httex1. Vi mener at enkelhet, effektivitet og robusthet av vår SUMO-fusion-basert metode vil gjøre innfødt, koden-ledig Httex1 mer tilgjengelig for forskere fra ulike disipliner og eliminere behovet for å bruke ikke-native sekvenser av Httex1 i vitro . Dette er et viktig fremskritt som vil lette fremtidige studier for å belyse struktur-funksjon forholdet mellom Httex1.
Protokollen beskriver rensing av Httex1 fra 12 L bakteriell kultur, men protokollen kan lett tilpasses for mindre eller større skala produksjoner. Protokollen beskriver produksjon av vill-type Httex1 (wtHttex1) med en polyQ gjenta lengde nedenfor (23Q) og mutant Httex1 (mHttex1) med en polyQ gjenta lengde over (43Q) patogene terskelen (36Q).
I denne protokollen, har vi skissert en effektiv fremgangsmåte for å få mg mengder av innfødt, umerkede Httex1 som inneholder 23 eller 43 glutamin rester. Dette ble oppnådd ved å uttrykke Httex1 som en C-terminalen fusjon til en hans6-SUMO-kode, som brukes til å isolere fusion protein fra cellen lysate IMAC og er kløyvde før HPLC rensing av Httex1. Mens SUMO strategien har blitt brukt i produksjonen av flere andre proteiner, viser vår metode at de unike egenskapene SUMO kan også brukes til å generere egentlig disordered, aggregering utsatt, amyloidogenic protein som har tidligere vist seg å være ekstremt vanskelig å håndtere og produsere43,44. Vi presenterer en protokoll som er enkelt, brukervennlig og sammenlignes med en protokoll for generering av et “veloppdragen” protein. SUMO fusion solubilizes og stabiliserer Httex1 uttrykk og IMAC rensing trinn. Tidlig spalting av koden, som observert med intein strategi10 og samling var ikke lenger et problem.
Egentlig uordnede proteiner er spesielt sårbare for degradering. N-terminal fornedrelse i regionen N17 er ikke et problem som bruker denne protokollen, kan det oppstå truncations i PRD Httex1. Som avkortet proteiner er svært lik Httex1, hydrophobicity og størrelse, fjerne dem av brukt kromatografiske betyr er utfordrende, så det er best å unngå deres dannelse i første omgang. Stikker tett til protokollen, burde alltid jobber på isen og bruker en tilstrekkelig mengde protease hemmer hjelpe holde nivået av observerte trunkering svært lav. Bruke en fusion-kode på C-terminus av Httex1 kan fjerne truncations i PRD lett som avkortet protein ville miste affinitet koden også. Hvis den opprinnelige rekkefølgen må være dette alternativet ikke kan brukes som Httex1 slutter med proline og best av vår kunnskap er det imidlertid ingen C-terminalen fusion koder som kan indusere traceless og effektiv cleavage etter proline.
Den mest kritiske delen av protokollen er håndtering av Httex1 frigjort etter spalting av SUMO koden av ULP1. Protein bør renses umiddelbart RP-HPLC. Heldigvis er en effektiv og rask reaksjon som er vanligvis gjennomført i 10-20 minutter til 4 ° C. Derimot intein strategien kreves flere timer for komplett spalting av intein, noe som krever en avveining mellom ufullstendig cleavage og begynnelsen samling for å maksimere avkastningen. En rask workup kreves for mutant Httex1, som det vil begynne å samle på den relativt høye konsentrasjonen i spalting reaksjonen, mens 23Q varianten er stabile i lengre tid. Under RP-HPLC rensing, en annen fordel med SUMO blir klart: mens Ssp DnaB intein er hydrofobe og stikker sterkt til kolonnen, SUMO er mer hydrofile og elutes helt fra kolonnen C4 reverseres-fase. Selv om kommersielle ULP1 er ganske dyrt, kan protein lett produseres i høy avkastning etter publisert tidligere protokoller29.
Den kritiske viktigheten av å bruke en disaggregation protokoll før Httex1 kan ikke understrekes nok. Lyofilisert polyQ proteiner som Httex1 er stabilt og kan være lagret lange perioder, men er ikke fullstendig oppløselig i vann og buffere. Preformed oligomers eller fibrils kunne ha en betydelig innvirkning på aggregering kinetics og Biofysiske egenskaper protein45. Disaggregation protokollen beskrevet her kan disaggregation av protein, fjerning av preformed aggregater og generasjon i en løsning av monomerisk Httex1 fra et lyofilisert utvalg. Vi observerte lignende aggregering kinetics og fibril morfologi for Httex1 med SUMO og intein strategi.
Sammenlignet med tidligere metoder for å produsere Httex1, SUMO strategi beskrevet her tilbyr flere fordeler og utvider utvalget av mulige studier for å undersøke strukturen og funksjonelle egenskaper av dette proteinet i helse og sykdom. SUMO-Httex1 fusion protein er lett å håndtere, det kan være frosset og lagret eller holdt i løsning for 24 h ved omgivelsestemperatur, mens den gratis mHttex1 samler raskt. Stabilitet og høy Løseligheten av SUMO-Httex1 fusion proteiner gir større fleksibilitet til å manipulere protein og/eller presentere enzymatisk og kjemiske endringer i mHttex1 som ellers ikke ville være mulig etter cleavage. Dette omfatter innføring av post-translasjonell modifikasjoner, fluorophores, spin etiketter, biotin tags, etc. fremskritt presenteres her bør 1) lette fremtidige studier for å belyse struktur-funksjon relasjoner av Httex1; 2) generere nye verktøy for å undersøke Htt aggregering og patologi spre; 3) Aktiver utviklingen av nye analyser til å identifisere molekyler som stabilisere mutant Httex1 og hindre dens samling; og 4) oppmuntre forskere fra andre felt å bringe til arbeid på dette proteinet og bli vår søken for å finne kurer for Huntingtons sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra CHDI foundation og sveitsiske National Science Foundation. Vi takker Dr. Sophie Vieweg for nyttig diskusjoner under utviklingen av denne nye uttrykk-systemet og andre medlemmer av gruppen Lashuel for å dele sine erfaringer med denne uttrykket systemet og deres input og verdifulle tilbakemeldinger. Vi takker også Prof Oliver Hantschel for å gi ULP1 plasmider. Forfatterne takker Dr. John B. Warner og Dr. Senthil K. Thangaraj for kritisk gjennomgang av manuskriptet
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) | EMS | 22450 | |
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids | EMS | FCF200-Cu-50 | |
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics | HellmaAnalytics | 110-1-40 | |
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA | Witech | SVA4730203 | |
Ampicillin | AxonLab | A0839.0100 | |
Luria Broth (Miller's LB Broth) | Chemie Brunschwig | 1551.05 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | AxonLab | A1008.0025 | |
E. coli B ER2566 | NEB | NEB# E4130 | |
Imidazole | Sigma | 56750-500G | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 | Merck Millipore Corporation | MAB5492 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) | Licor | 925-68070 | |
PMSF | AxonLab | A0999.0005 | |
HisPrep 16/10 column | GE Healthcare | 28936551 | |
C4 HPLC column | Phenomenex | 00G-4168.P0 | 10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19×10 mm guard column, not temperature jacketed |
Acetonitrile HPLC | MachereyNagel | C2502 | |
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile | Sarstedt AG | 83.1826 | |
Spectrophotometer semi-micro cuvette | Reactolab S.A. | 2534 | |
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml | GE Healthcare | 18111382 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml | Greiner Bio-One | 7.160 102 | |
100 kD Microcon fast flow filters | Merck Millipore Corporation | MRCF0R100 | |
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor | Sonics | ||
Äkta 900 equipped with a fraction collector | GE Healthcare | ||
Jasco J-815 Circular Dichroism | Jasco | ||
Waters UPLC system | Waters | C8 BEH acquity 2.1×100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL | |
waters HPLC system | Waters | 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing | |
ESI-MS: Finnigan LTQ | Thermo Fisher Scientific | ||
lyophylizer instrument | FreeZone 2.5 Plus | ||
Tecnai Spirit BioTWIN | FEI | electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV | |
37 °C shaking incubator | Infors HT multitron Standard | ||
Biophotometer plus | Eppendorf |