Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken
Summary
Presenteren we een methode die kan nadere inzichten in de vroege gebeurtenissen onderliggende neurodegeneratie en gebaseerd op de gevestigde ex-vivo hersenen techniek, combineren de voordelen van in vivo en in vitro experimenten. Bovendien heeft het een unieke kans voor directe vergelijking van behandelde en onbehandelde groep in hetzelfde anatomische vlak vertegenwoordigt.
Abstract
Ondanks talrijke studies die probeert te ontwikkelen betrouwbare diermodellen, welke als gevolg van de primaire onderliggende neurodegeneratie processen, zijn zeer weinigen algemeen aanvaard. Hier stellen wij een nieuwe procedure aangepast uit de bekende ex vivo hersenen segment techniek, die een dichter in vivo biedt-als scenario dan in vitro preparaten, voor het onderzoeken van de vroege gebeurtenissen triggering cel degeneratie, als waargenomen in de ziekte van Alzheimer (AD). Deze variatie bestaat uit eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbaar stappen, waarmee behoud van de anatomische cytoarchitecture van de geselecteerde hersenen-regio en de lokale functionaliteit in een fysiologische milieu. Verschillende anatomische gebieden kunnen worden verkregen van de dezelfde hersenen, bieden de mogelijkheid voor het uitvoeren van meerdere experimenten met de behandelingen in kwestie in een site – dosis- en tijd-afhankelijke manier. Mogelijke beperkingen die invloed kunnen hebben op de resultaten die aan deze methode gerelateerde gerelateerd zijn aan het behoud van het weefsel, dat wil zeggen, de handhaving van de anatomische integriteit tijdens het snijden en incubatie stappen en de dikte van de sectie, die kunnen beïnvloeden de biochemische en immunohistochemische analyse. Deze aanpak kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, zoals het verkennen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de fysiologische of pathologische voorwaarden, drug screening of testen van de dosis-respons. Dit protocol kan ten slotte ook verminderen het aantal dieren in loondienst in behavioral studies. De toepassing gemeld hier is onlangs beschreven en getest voor de eerste keer op ex vivo rat hersenen segmenten met de basale reukkolf (BF), die tot de cerebrale regio’s voornamelijk beïnvloed in AD behoort. In het bijzonder is gebleken dat het beheer van een giftige peptide afgeleid van de C-terminus van acetylcholinesterase (AChE) zou kunnen een AD-achtige profiel vragen, triggering, langs de as antero-posterior van de BF, een differentiële expressie van eiwitten gewijzigd in AD, zoals de alpha7 nicotinerge receptor (α7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau) en bèta amyloid (Aβ).
Introduction
AD is dat een chronische pathologie gekenmerkt door geleidelijke neurodegeneratieve stoornis op het gebied van verschillende hersengebieden, zoals de Entorinale cortex (EG), BF, hippocampus (HC) en bulbus olfactorius (OB)1,2,3, 4,5. De late stadia van AD ontwikkeling leiden tot een geleidelijke daling van de cognitieve, waardoor deze ziekte de meest voorkomende vorm van dementie, ongeveer goed voor 70% van alle gevallen6. Ondanks uitgebreide pogingen om te begrijpen van de beginfase veroorzaakt AD, is er momenteel niet een gedefinieerde experimentele indicatie ophelderen van hen. Bovendien, de meest populaire theorie – de “amyloïde hypothese” – is steeds meer in twijfel getrokken omdat het voorziet niet in een compleet profiel in het verklaren van de AD-pathobiology, noch een farmaceutische doel dat heeft bewezen effectieve7,8 ,9.
Een alternatieve theorie, die steeds meer aandacht krijgt suggereert dat de oorspronkelijke mechanismen die zich voordoen tijdens neurodegeneratie zijn gerelateerd aan een neuronale cluster vooral gevoelig in AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. deze heterogene cellulaire hub omvatte binnen de BF, veroorzaakt en hersenstam, projecten aan veelvoudige gebieden, zoals de EG, HC en OB15,16. Ondanks haar diversiteit in neuronale morfologie en synthese van de neurotransmitter deelt deze kern van cellen een gemeenschappelijk kenmerk in het uiten van pijn, die ook een niet-enzymatische functie17,18kan hebben. Deze niet-klassieke rol als een roman signalering molecuul bemiddelt calcium (Ca2 +) stroom in neuronen die kan ondergaan trofische of giftige gebeurtenissen met betrekking tot Ca2 + dosis, beschikbaarheid en neuronale leeftijd17,18 , 19.
Tijdens neurodegeneratie, misschien de waargenomen cellulaire verlies wel daarom gekoppeld aan deze niet-enzymatische functie17,18,20, die te wijten is aan een 30mer peptide (T30) gekloofd uit de AChE C-terminus 20. in overeenstemming met de resultaten van de vorige, uitgevoerd op celcultuur en optische beeldvorming18,21 preparaten, we laten zien, door middel van een nieuwe benadering, gebaseerd op ex vivo rat hersenen segmenten met BF structuren, die T30 geïnduceerde een AD-achtige profiel22. Specifiek, biedt deze nieuwe methodiek een meer fysiologische scenario dan celkweek aangezien het onderhoudt veel van de kenmerken van een intact weefsel, variërend van anatomische aan circuits behoud, zij het om een tijdsinterval van uren. We toegepast dit protocol om te verkennen van de gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de vroege stadia van neurodegeneratie, toezicht op het acute respons T30 voor de aanvraag.
Ondanks de grote hoeveelheid literatuur over het gebruik van hersenen segmenten te onderzoeken van moleculaire pathways geïmpliceerd in neuronale schade of neurogenese23,24, dit protocol voorziet in de eerste keer een meer directe en gevoelige voorgelezen in vergelijking het gemeenschappelijk gebruik van segmenten van de organotypic. Echter kan is het geval voor organotypic hersenen secties, deze acute segment procedure ook worden vastgesteld voor verschillende doeleinden, zoals de beoordeling van neuroprotectieve of neurotoxische moleculen, ontdekking van primaire moleculaire veranderingen in een specifiek proces, analyse van Immunohistochemical en farmacologische testen voor centraal zenuwstelsel gerelateerde aandoeningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belangrijkste aspect van dit protocol, gebaseerd op de reeds lang gevestigde ex vivo hersenen techniek, maakt het mogelijk om synchroon test twee spiegelende hemislices, verkregen uit hetzelfde anatomische vlak, toezicht op hun reactie na de toepassing van een specifieke voorwaarde (controleren of behandeling); Dit biedt dus een experimentele paradigma zo strak mogelijk worden gecontroleerd. De mogelijkheid om in een tijd – dosis- en site-specifieke wijze verschillende neurotransmitters aan neuronale bijzond…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Neuro-Bio Ltd. Wij wil Dr. Giovanni Ferrati en Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) bedanken voor hun opmerkingen en advies over het manuscript.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer’s disease–interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer’s pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer’s disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer’s disease: olfactory bulb is involved in early Braak’s stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer’s disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer’s Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer’s disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer’s disease: cortical or subcortical?. Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or Side Show?. Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neurosciences. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson’s Disease, Alzheimer’s Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer’s Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
