Gør, afprøvning og brug af kalium Ion selektive Microelectrodes i væv skiver af voksne hjerne
Summary
Kalium ioner bidrage til hvile membranen potentiale celler og ekstracellulære K+ koncentration er en afgørende regulator af cellulære ophidselse. Vi beskriver hvordan man laver, kalibrere og bruge monopolære K+-selektive microelectrodes. Ved hjælp af sådanne elektroder kan måling af elektrisk evoked K+ koncentration dynamics i voksen hippocampus skiver.
Abstract
Kalium ioner bidrage væsentligt til den hvilende membranen potentiale celler og ekstracellulære K+ koncentration er derfor en afgørende regulator af celle ophidselse. Ændret koncentrationer af ekstracellulære K+ påvirker den hvilende membran potentiale og cellulære ophidselse ved at flytte ligevægt mellem lukket, åben og inaktiveret stater for spænding-afhængige Ionkanaler, der ligger bag aktionspotentialet indledning og varmeledning. Derfor er det værdifuldt at direkte måle ekstracellulære K+ dynamics i sundheds- og syge stater. Her, vi beskriver hvordan man laver, kalibrere og bruge monopolære K+-selektive microelectrodes. Vi indsatte dem i voksen hippocampus hjernen skiver til at måle elektrisk evoked K+ koncentration dynamics. Fornuftig brug af sådanne elektroder er en vigtig del af den værktøjskasse, der er nødvendige for at evaluere cellulære og Biofysisk mekanismer, der styrer ekstracellulære K+ koncentrationer i nervesystemet.
Introduction
Kalium ion koncentrationer er stramt reguleret i hjernen, og deres udsving øve en stærk indflydelse på den hvilende membran potentiale af alle celler. I lyset af disse kritiske bidrag er et vigtigt mål for biologi til at bestemme de cellulære og Biofysisk mekanismer, der anvendes til stramt regulere koncentrationen af K+ i det ekstracellulære rum i forskellige organer i kroppen1 , 2. et vigtigt krav i disse undersøgelser er evnen til at måle K+ koncentrationer præcist. Selv om mange komponenter, som bidrager til kalium homøostase i hjernen i raske og syge stater har været identificeret3,4,5, er yderligere fremskridt blevet bremset på grund af specialiserede karakter forberede ion selektiv microelectrodes for kalium måling. Mikroelektrode sensorer repræsenterer den gyldne standard for måling af K+ koncentrationer i vitro, i væv skiver og in vivo.
Nyere tilgange for K+ overvågning er under udvikling ved hjælp af optiske sensorer, men disse registrerer ikke en biologisk relevante vifte af K+ koncentrationer eller har ikke været fuldt undersøgt i biologiske systemer, selv om de første resultater synes lovende6,7,8. Sammenlignet med optiske sensorer, er microelectrodes principielt begrænset til en punktkilde måling af ioner, selvom elektrode arrays kunne forbedre den rumlige opløsning9. Denne artikel fokuserer på single-barreled mikroelektrode sensorer til overvågning K+ dynamics.
I dette arbejde, vi rapportere detaljeret trinvis procedurer at gøre K+ selektive microelectrodes, ved hjælp af en valinomycin-baseret kalium ionophor, der tillader yderst selektiv (4 10 K+ fold til Na+ selektivitet) K+ bevægelse over membraner10. En naturligt forekommende polypeptid, valinomycin fungerer som en K+ gennemtrængelig pore og letter strømmen af K+ ned den elektrokemiske gradient. Vi beskriver også, hvordan man kalibrere elektroderne, hvordan man kan gemme og bruge dem og endelig hvordan du installerer dem til at måle K+ koncentration dynamics i akut hippocampus hjernen skiver fra voksne mus. Brugen af sådanne elektroder samt genmodificerede mus, der mangler specifikke Ionkanaler foreslået at regulere ekstracellulære K+ dynamics skal afsløre de cellulære mekanismer, der bruges af nervesystemet til at kontrollere den omgivende koncentration af K + i det ekstracellulære miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metode, som vi beskriver her har tilladt os at vurdere K+ dynamics svar på elektrisk stimulation af Schaffer soeskende i akut hippocampus skiver fra voksne mus. Vores metode til at forberede K+ ion selektiv microelectrodes minder tidligere beskrevne procedurer12,13,14,15. Dog, denne metode har fordele i forhold til alternative elektrode konfigurationer i, at det er hu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Khakh lab blev støttet af NIH MH104069. Den Mody lab blev støttet af NIH NS030549. J.C.O. tak NIH T32 neurale mikrokredsløb uddannelse Grant(NS058280).
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA – Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
