Summary

Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

Íons de potássio contribuem para o descanso potencial de membrana das células e a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade celular. Descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Usar tais eletrodos permite a medição da dinâmica de concentração de K+ eletricamente evocada em fatias hippocampal adultas.

Abstract

Íons de potássio contribuem significativamente para o descanso potencial de membrana das células e, portanto, a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade da célula. Alterou a concentrações extracelulares K+ vai afectar a excitabilidade de celular e potenciais de membrana de descanso deslocando o equilíbrio entre Estados fechados, abertos e inativados para canais dependentes de voltagem íon que fundamentam o potencial de ação iniciação e condução. Portanto, é valioso para medir diretamente o extracelular K+ dinâmica na saúde e Estados doentes. Aqui, descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Nós lhes implantado em fatias hippocampal cérebro de um adulto para medir evocada eletricamente dinâmica de concentração de K+ . O uso criterioso de tais eletrodos é uma parte importante do kit de ferramentas necessária para avaliar os mecanismos celulares e biofísicos que controlam a concentração extracelular de K+ no sistema nervoso.

Introduction

Concentrações de íons potássio estão fortemente regulamentadas no cérebro, e suas flutuações exercem uma poderosa influência sobre o potencial de membrana descanso de todas as células. À luz destas contribuições críticas, um objectivo importante da biologia é determinar os mecanismos celulares e biofísicos que são usados para regular firmemente a concentração de K+ no espaço extracelular em diferentes órgãos do corpo1 , 2. a capacidade de medir concentrações de K+ com precisão, constitui um requisito importante nestes estudos. Apesar de muitos componentes que contribuem para a homeostase do potássio no cérebro em Estados saudáveis e doentes foram identificados3,4,5, ainda mais progresso tem sido abrandado devido à natureza especializada do preparando íon seletivo microeletrodos para medição de potássio. Sensores de microeletrodos representam o padrão de ouro para medir K+ concentrações em vitro, em fatias de tecido e em vivo.

Novos enfoques para K+ de monitoramento estão em desenvolvimento utilizando sensores ópticos, porém estes não detectar uma gama biologicamente relevantes de K+ concentrações ou já não foram totalmente analisados em sistemas biológicos, embora os resultados iniciais Parece promissor,6,7,8. Comparado com sensores ópticos, microeletrodos são fundamentalmente limitados a uma medição de ponto fonte de íons, embora matrizes eletrodo poderiam melhorar a resolução espacial9. Este artigo enfoca os sensores de cano único microeletrodos para monitoração dinâmica K+ .

Neste trabalho, relatamos os procedimentos detalhados em etapas para fazer K+ seletivos microeletrodos, usando um ionóforo de potássio valinomicina-baseado que permite altamente seletivo (dobra4 10 K+ a seletividade Na+ ) K+ movimentação de membranas10. Um polipeptídeo natural, valinomicina atua como um poro permeável K+ e facilita o fluxo de K+ para baixo é um gradiente electroquímico. Também descreveremos como calibrar os eletrodos, como armazenar e usá-los e, finalmente, como implantá-las para medir a dinâmica de concentração K+ em fatias aguda hippocampal cérebro de ratos adultos. O uso de tais eletrodos juntamente com ratos geneticamente modificados que não possuem canais de íon específico propostos para regular extracelular K+ dinâmica deve revelar os mecanismos celulares usados pelo sistema nervoso para controlar a concentração ambiente de K + no meio extracelular.

Protocol

Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com o Instituto Nacional de saúde-guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa Animal do Chanceler a Universidade da Califórnia, Los Angeles. Todos os ratos foram alojados com comida e água disponível ad libitum em um ambiente de claro-escuro de 12 h. Todos os animais eram saudáveis sem alterações comportamentais óbvias, não estavam envolvidos em estudos anteriores e foram sacrificados …

Representative Results

Para a medição selectiva de extracelular K+, preparamos íon-seletivo microeletrodos revestidos com uma camada hidrofóbica através de silanização de pipetas de vidro de borosilicato limpo (figura 1A). Este revestimento permite que o ionóforo K+ contendo valinomicina para descansar na ponta do eletrodo e permitir apenas K+ fluxo através de uma abertura estreita na ponta do eletrodo (figura 1B</stron…

Discussion

O método que descrevemos aqui nos permitiu avaliar a dinâmica de K+ , em resposta à estimulação elétrica de colaterais de Schaffer em fatias hippocampal agudas de ratos adultos. Nosso método de preparação K+ microeletrodos seletiva de íons é semelhante a procedimentos anteriormente descritos12,13,14,15. No entanto, este método tem vantagens sobre configuraçõe…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O laboratório de Khakh foi apoiado pelo NIH MH104069. O laboratório Mody foi apoiado pelo NIH NS030549. J.C.O. graças a Grant(NS058280) de formação do NIH T32 Neural microcircuitos.

Materials

Vibratome DSK Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice Taconic Stock#B6
Microscope Olympus BX51
Electrode puller Sutter P-97
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2
pCLAMP10.3 Molecular Devices n/a
Custom microfil 28G tip World precision instruments CMF28G
Tungsten Rod A-M Systems 716000
Bipolar stimulating electrodes FHC MX21XEW(T01)
Stimulus isolator World precision instruments A365
Grass S88 Stimulator Grass Instruments Company S88
Borosilicate glass pipettes World precision instruments 1B150-4
A to D board Digidata 1322A Axon Instruments
Signal Amplifier Multiclamp 700A or 700B Axon Instruments
Headstage CV-7B Cat 1 Axon Instruments
Patch computer Dell n/a
Sodium Chloride Sigma S5886
Potassium Chloride Sigma P3911
HEPES Sigma H3375
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S0751
D-glucose Sigma G7528
Calcium Chloride Sigma 21108
Magnesium Chloride Sigma M8266
valinomycin Sigma V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene Sigma 40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate Sigma 60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane Sigma 85126-5ml
TTX Cayman Chemical Company 14964
Hydrochloric acid Sigma H1758-500mL
Sucrose Sigma S9378-5kg
Pipette Micromanipulator Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens Olympus PlanAPO 10xW

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Citer Cet Article
Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. J. Vis. Exp. (135), e57511, doi:10.3791/57511 (2018).

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