Toeprinting analyse af oversættelse indledningen kompleks dannelse på pattedyr mRNAs
Summary
Toeprinting har til formål at måle evne til i vitro transskriberet RNA til form oversættelse indledningen komplekser med ribosomer under forskellige betingelser. Denne protokol beskriver en metode til toeprinting pattedyr RNA og kan bruges til at studere både cap-afhængige og IRES-drevet oversættelse.
Abstract
Oversættelse indledningen er det hastighedsbegrænsende trin i proteinsyntese og udgør et centralt punkt, hvor cellerne regulerer deres protein produktion. Regulering af proteinsyntesen er nøglen til cellulære stress-respons, og dysregulering er centralt i mange sygdomstilstande, såsom kræft. For eksempel, selv om cellulært stress fører til hæmning af globale oversættelse af formildende cap-afhængige indledning, visse stress-respons proteiner selektivt er oversat i en cap-uafhængig måde. Diskret RNA regulerende elementer, såsom cellulære intern ribosom indrejse steder (IRESes), giver mulighed for oversættelsen af disse specifikke mRNAs. Identifikation af sådanne mRNAs og karakterisering af deres reguleringsmekanismer, har været et centralt område i Molekylærbiologi. Toeprinting er en metode til undersøgelse af RNA struktur og funktion, som den vedrører oversættelse indledningen. Målet med toeprinting er at vurdere evne til i vitro transskriberet RNA til at danne stabile komplekser med ribosomer under en række betingelser, for at afgøre, hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er involveret i ribosomet bindende — en pre-cursor for effektiv oversættelse indledningen. Sammen med andre teknikker, såsom vestlige analyse og polysome profilering, giver toeprinting mulighed for en robust karakterisering af mekanismer til regulering af oversættelse indledningen.
Introduction
Som oversættelse forbruger mest cellulære energi, giver det mening at oversættelsen er stramt reguleret1. Omvendt dysregulering af oversættelsen- og de deraf følgende ændringer i protein output-er ofte observeret i stress-respons og sygdom stater, såsom kræft1,2. En stor fordel for Translationel kontrol er den hastighed, hvormed cellerne kan ændre deres protein output for at reagere på forskellige stimuli3. Oversættelse forordning udgør således en vigtig mekanisme, der kan påvirke celle overlevelse og død1,2,3. Af trinene i oversættelse er indledning den de fleste stærkt reguleret og komplekse3. Kort, mest eukaryote mRNAs indeholder en 5′ m7G cap, der næsten altid er afgørende for deres oversættelse. Cap-afhængige indledningen kræver eukaryote indledning faktorer eIF4E, eIF4A og eIF4G (fælles landbrugspolitik-anerkendelse komplekse) at interagere med 5′ enden af mRNA. 43S preinitiation ribosomet kompleks, som indeholder eIF2-bundet initiativtager tRNA og eIF3, er rekrutteret til 5′-enden af mRNA via et samspil mellem eIF4G og eIF3. Preinitiation komplekse menes at scanne mRNA, hjulpet af eIF4A (et RNA-helicase) indtil start codon (AUG) er placeret. 48S indledning komplekse dannede efterfølgende og tRNA leveres i P-site af ribosomet. Endelig er 60S og 40S ribosom underenheder forenet til at danne 80S indledning komplekse, efterfulgt af oversættelse brudforlængelse1,3,4. Derimod omgå intern ribosom indrejse steder (IRESes) kravet om en 5′ fælles landbrugspolitik ved at rekruttere 40S ribosomale subunit direkte til indledning codon3. Fysiologiske stress betingelser dæmpe globale mRNA oversættelse på grund af ændringer af vigtige generelle eukaryote indledning faktorer (eIFs). Dog ikke-kanoniske oversættelse indledningen mekanismer mulighed for selektiv oversættelse af visse mRNAs, som ofte indkode stress-respons proteiner, og dysregulering af ikke-kanoniske oversættelse indledningen er involveret i sygdomstilstande som kræft 1 , 2. diskret RNA regulerende elementer, såsom cellulære IRESes, giver mulighed for oversættelse af sådanne mRNAs2,3.
Et særligt interessant aspekt af Translationel kontrol er at forstå mekanismerne for kanoniske versus ikke-kanoniske oversættelse af en given mRNA. Toeprinting er en teknik, der giver mulighed for detaljerede mekanistiske studier af oversættelse indledningen af specifikke RNA’er in vitro. Det overordnede mål med toeprinting er at vurdere muligheden for en RNA af interesse at samme dannelsen af en oversættelse indledningen kompleks med ribosomet under en række betingelser, for at afgøre, hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er nødvendige for effektiv oversættelse indledningen. For eksempel kan ribosomet rekruttering hæmmes i mangel af en 5′ cap men stimuleres af tilstedeværelsen af en IRES.
Princippet for teknikken er til in vitro- omskrive en RNA af interesse, inkuberes det i overværelse af cellulære ekstrakter som indeholder komponenter, oversættelse (eller de renset dele) for at tillade indledning komplekser til form og vende transskribere RNA med en specifik primer. Stabil RNA-ribosomet komplekser vil forårsage reverse transkription til stall på 3′ kanten af ribosomet-den såkaldte ‘toeprint’5,6,7.
I denne protokol, ribosomale underenheder, eIFs, tRNAer og IRES trans-virkende faktorer (ITAFs) er bekvemt bidraget af kanin reticulocyte lysate (RRL). En anden fordel ved denne protokol er brugen af en fluorescently mærket primer og fluorescens gel-baserede imager, snarere end en radiolabeled primer. Dette eliminerer ekstra foranstaltninger, herunder radiolabeling primer, samt tørring gel og udsætte den for en intensivere skærm. De fluorescerende bands registreres i realtid, som gel kører, giver mulighed for højere opløsning. Ikke-reducerede X-linked hæmmer af apoptose proteiner (XIAP) IRES RNA er brugt som et eksempel her, selvom udjævnede mRNAs kan også analyseres ved denne teknik8.
I modsætning til vestlige analyser, som måler det endelige output af oversættelsesprocessen i cellelysater, er toeprinting en in vitro- metode til at måle oversættelse indledningen kompleks dannelse på en RNA. Denne reduktionistiske tilgang giver mulighed for meget detaljerede undersøgelse af substrater eller faktorer, der regulerer oversættelse indledningen (fx., loft eller un-udjævnede mRNA, IRES struktur, tilstedeværelse eller fravær af poly-en hale, bestemmelse af specifikke protein faktorer, etc.). Toeprinting kan dermed bruges til at studere forskellige former for oversættelse8 eller virkningerne af mRNA strukturer, såsom IRESes, protein syntese9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting er en effektiv teknik til direkte måle evne af en RNA af interesse at støtte dannelsen af oversættelse indledningen komplekser under stærkt kontrollerede forhold. Denne protokol beskriver en forenklet teknik for toeprinting pattedyr RNA’er. Kanin reticulocyte lysate (RRL) bruges som en bekvem kilde af ribosomer, eIFs, initiativtager tRNA og IRES trans-handler faktorer (ITAFs). Eksperimentatoren giver deres RNA valg, og kan også supplere toeprinting reaktionen med specifikke cofaktorer for deres …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af en naturvidenskab og teknisk forskning Rådet af Canada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), Canada Foundation for Innovation-John R. Evans ledere fond (35017), Campus Alberta innoverer Program og Alberta Miljøministeriet Økonomisk udvikling og handel.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
