Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi
Summary
Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.
Abstract
Çeviri başlatma hızı sınırlaması adım protein sentezi ve hangi hücrelerin protein çıktılarını düzenleyen önemli bir nokta temsil eder. Düzenleme protein sentezi, hücresel stres tepkisi anahtarıdır ve bozukluk birçok hastalık durumlarında, kanser gibi merkezi bir noktada bulunuyor. Örneğin, hücresel stres küresel çeviri inhibisyonu inceltiyorum kap bağımlı başlatma tarafından leads rağmen bazı stres tepkisi proteinler seçerek bir kap bağımsız şekilde çevrilir. Hücresel iç ribozom giriş siteleri (IRESes), gibi sağduyulu RNA düzenleyici elemanlarının bu belirli mRNA’ların çeviri için izin. Böyle mRNA’ların tanımlaması ve düzenleyici mekanizmaları, karakterizasyonu Moleküler biyolojide önemli bir alan olmuştur. Gibi çeviri başlatma için ilgilidir Toeprinting, RNA yapısı ve işlevi için bir yöntemdir. Toeprinting vitro yeteneği değerlendirmek için hangi dizileri, yapı elemanlarının veya aksesuar faktörler ribozom içinde söz konusu belirlemek için koşullar, çeşitli altında ribozomlar ile kararlı kompleksler oluşturmak için RNA transkripsiyonu hedeftir bağlama — için verimli çeviri başlatma öncesi bir imleç. Batı analiz ve polysome profil oluşturma, gibi diğer teknikleri ile birlikte çeviri başlatma düzenlenmesi için mekanizmalar sağlam bir karakterizasyonu için toeprinting sağlar.
Introduction
Çevirisi en hücresel enerji tüketir gibi bu çeviri sıkıca düzenlenmiş1olduğunu mantıklı. Diğer taraftan, bozukluk çeviri-protein çıktı bunun sonucunda değişiklik ve -genellikle kanser1,2gibi stres tepkisi ve hastalık durumları görülmektedir. Translasyonel kontrol önemli bir avantajı olan çeşitli uyaranlara3‘ e cevap için protein çıktılarını hücreleri değiştirebilirsiniz hızıdır. Çeviri yönetmelik böylece hücre yaşam ve ölüm1,2,3etkileyebilecek önemli bir mekanizma temsil eder. Çeviri adımlardan inisiyasyon en son derece düzenli ve karmaşık3‘ tür. Kısaca, en ökaryotik mRNA’ların hemen hemen her zaman onların çeviri için gerekli olan bir 5’ m7G başlık içerir. Cap-bağımlı başlatma gerektirir ökaryotik başlama faktörleri eIF4E, Eıf4a ve eIF4G (cap-tanıma kompleksi 5′ uç mRNA ile etkileşim kurmak için). EIF2 bağlı Başlatıcı içeren 43S preinitiation ribozom karmaşık, tRNA ve eIF3, 5′ sonuna kadar mRNA yolu ile eIF4G eIF3 ile bir etkileşim işe. Karmaşık preinitiation Eıf4a tarafından destekli mRNA, tarama düşünülmektedir (RNA helikaz) başlama kodonu (AUG) bulunana kadar. Karmaşık 48S başlatma sonradan oluşmuş ve tRNA ribozom P-site teslim edilir. Son olarak, 60’lar ve 40’lı ribozom alt birimleri karmaşık, 80S başlatma oluşturmak için çeviri uzama1,3,4tarafından takip Birleşmiş. Buna ek olarak, iç ribozom giriş siteleri (IRESes) 40’lı ribozomal altbirimde başlama kodonu3için doğrudan işe alma tarafından 5′ başlık gereksinimini devre dışı. Fizyolojik stres koşulları küresel mRNA çeviri değişikliklerini anahtar genel ökaryotik başlama faktörleri (mantolama) nedeniyle azalt. Ancak, kanonik olmayan çeviri başlatma mekanizmaları genellikle stres tepkisi protein kodlamak belirli mRNA seçici çeviri için izin ve kanonik olmayan çeviri inisiyasyon bozukluk gibi kanser hastalığı Devletleri’nde karıştığı 1 , 2. gizli RNA gibi hücresel IRESes, düzenleyici elemanlarının izin böyle mRNA’ların2,3çeviri için.
Bir özellikle ilginç yönü translasyonel kontrol mekanizmaları karşı verilen bir mRNA kanonik olmayan çeviri kurallı anlamaktır. Toeprinting belirli RNA’ların içinde vitroinisiyasyon çeviri ayrıntılı mekanik çalışma sağlayan bir tekniktir. Toeprinting genel amacı bir RNA ilgi hangi dizileri, yapı elemanlarının veya aksesuar belirlemek için bir çeviri başlatma koşulları, çeşitli altında ribozom ile karmaşık oluşumu nucleate yeteneği değerlendirmek etmektir verimli çeviri kabul töreni için gerekli faktörlerdir. Örneğin, ribozom işe alım 5′ başlık yokluğunda engel ama bir IRES varlığı ile uyarılmış.
Vitro için teknik bir ilkesidir ilgi bir RNA uyarlamak başlatma kompleksleri forma ve tersine çevirmek için uyarlamak izin vermek için çeviri bileşenleri (veya saf bileşenleri) içeren hücre özleri huzurunda kuluçkaya RNA ile belirli bir astar. İstikrarlı RNA-ribozom kompleksleri 3′ kenarında ribozom sözde ‘toeprint’5,6,7durak ters transkripsiyon neden olur.
Bu iletişim kuralı, ribozomal alt birimleri, mantolama, tRNA ve IRES trans-oyunculuk faktörler (ITAFs) uygun tarafından tavşan Retikülosit lysate (RRL) katkıda bulunmuştur. Bu iletişim kuralı bir diğer avantajı radiolabeled astar yerine fluorescently etiketli bir astar ve floresan jel tabanlı Imager kullanmaktır. Bu astar, radiolabeling gibi jel kurutma ve kuvvetlenmesine ekranına açığa dahil olmak üzere ek adımlar ortadan kaldırır. Floresan bantları gerçek zamanlı olarak, daha fazla çözümleme için izin jel ishal olarak kaydedilir. Her ne kadar çok Millî olan mRNA’ların da bu tekniği8tarafından analiz edilebilir kapağını X’e inhibitörü Apoptozis protein (XIAP) IRES RNA’ın burada, bir örnek kullanılır.
Hücre lysates çeviri sürecinde son çıktı ölçer, Batı analiz farklı olarak, toeprinting bir RNA çeviri başlatma karmaşık oluşumu ölçmek için vitro yaklaşımıdır. Bu indirgemeci yaklaşımın yüzeylerde veya çeviri başlatma düzenleyen faktörler son derece ayrıntılı bir çalışma için izin verir (örn., kaplama veya un kepli mRNA, IRES yapısı, varlığı ya da yokluğu Poli-A kuyruk, belirli protein faktörler, hükmü vs.). Bu nedenle, toeprinting çeviri8 farklı mod veya protein sentezi9,10IRESes gibi bir mRNA yapıları etkileri eğitimi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting doğrudan ilgi bir RNA çeviri başlatma kompleksleri son derece kontrollü koşullar altında oluşumunu desteklemek yeteneği ölçmek için güçlü bir tekniktir. Bu iletişim kuralı toeprinting için basitleştirilmiş bir teknik anlatılmaktadır memeli RNA’ların. Tavşan Retikülosit lysate (RRL) ribozomlar, mantolama, başlatıcı uygun kaynağı olarak kullanılan tRNA ve IRES trans-faktörler (ITAFs) hareket. Deneyci kendi RNA seçim sağlar ve ayrıca kendi seçtiğiniz belirli Kofaktör…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bir Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada-keşif Grant’ın (RGPIN-2017-05463), Kanada Vakfı tarafından yenilik-John R. Evans liderleri Fonu (35017), kampüs Alberta yeniliklerin programı ve Alberta Bakanlığı için finanse edildi Ekonomik kalkınma ve ticaret.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
