Homogène Time-resolved Förster Resonance Energy axée sur le transfert test pour la détection de l’insulinosécrétion

Summary

Nous présentons ici homogène temps résolu vous inquiétez (HTRF) comme une méthode efficace pour la détection rapide de l’insuline sécrétée par les cellules.

Abstract

La détection de la sécrétion d’insuline est cruciale pour élucider des mécanismes de sécrétion régulée ainsi comme dans les études de métabolisme. Bien que nombreux dosages d’insuline ont existé pendant des décennies, l’avènement récent de la technologie de Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) résolue en temps homogène a considérablement simplifié de ces mesures. Il s’agit d’un dosage rapid, rentable, reproductible et robuste optique dépendant des anticorps conjugués à des fluorophores lumineux dont les émissions de longue durée qui facilite la résolution temporelle Förster Resonance Energy Transfer. En outre, HTRF insuline détection est prête pour le développement des essais de criblage à haut débit. Ici, nous utilisons HTRF pour détecter la sécrétion d’insuline dans les cellules de l’INS-1E, une lignée de cellules dérivées d’insulinome de rat. Cela nous permet d’estimation du niveau basal de l’insuline et leurs modifications en réponse à la stimulation de la glycémie. En outre, nous utilisons ce système de détection de l’insuline pour confirmer le rôle de la dopamine comme un régulateur négatif de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). De manière similaire, les autres de la dopamine D₂-agonistes des récepteurs et quinpirole bromocriptine, GSIS de réduire d’une manière dose-dépendante. Nos résultats mettent en évidence l’utilité du format de dosage d’insuline HTRF pour déterminer le rôle de nombreux médicaments GSIS et leurs profils pharmacologiques.

Introduction

La régulation du métabolisme énergétique est affinée par une hormone anabolisante majeure, l’insuline. L’insuline est synthétisée et libérée par les cellules bêta du pancréas en réponse à des niveaux accrus de glucose extracellulaire. L’insuline libérée déclenche l’absorption du glucose par les tissus sensibles à l’insuline^1,2. Physiologiquement, cela est lié à l’élévation de la concentration de glucose après un repas, suivi par la sécrétion de l’insuline pour réguler l’absorption du glucose. Troubles de l’homéostasie du glucose conduisent à des déficiences métaboliques qui a abouti à la résistance à l’insuline et, finalement, dans la survenue du diabète de type 2 pour^2,3,4.

Bien que la sécrétion d’insuline a été particulièrement étudiée, ses mécanismes réglementaires restent mal compris. Un secteur critique de l’enquête a été l’identification de nouveaux modulateurs de la sécrétion d’insuline par les cellules bêta^5,6,7,8. Ces études nécessitent une meilleure compréhension de la relation de couplage entre la stimulation de glucose et de la sécrétion d’insuline. Par conséquent, la capacité de surveiller avec précision et de quantifier les niveaux de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) a été déterminante. A ce jour, cependant, seulement un nombre limité de méthodes était disponible pour permettre la quantification du GSIS utilisant des lignées de cellules sécrétrices d’insuline et/ou d’îlots pancréatiques. L’un est dosage radio-immunologique (RIA), qui utilise des anticorps et l’insuline radio-isotope-tag. Les principales limites de cette approche incluent des questions de sécurité en raison de la manipulation et l’élimination des matières radioactives. En outre, cette méthode est beaucoup de travail, impliquant plusieurs lavage long et les étapes d’incubation. Immuno enzymatique (ELISA) est une autre approche de coûteuse et fastidieuse qui utilise des anticorps pour la détection de l’insuline. Variation dans l’affinité de l’anticorps et l’efficacité de la reconnaissance de l’insuline sont des facteurs de cette méthode limitant et peuvent influer sur la reproductibilité des résultats. ELISA ni RIA a été conçu pour des expériences de haut débit. AlphaScreen est un dosage homogène utilisé pour détecter et mesurer les taux de sécrétion d’insuline. AlphaScreen technologie est basée sur la transformation de l’oxygène ambiant en un état singulet excité d’oxygène qui peut réagir avec des espèces de chimiluminescence, ayant pour résultat la génération de chimiluminescence. Parce que le dosage est homogène, d’entre les étapes de lavage associées à la RIA et ELISA sont éliminés. Cependant, l’instabilité du signal dû à la nature de la réaction est un facteur limitant qui peut-être affecter la lecture du test. () TR-pince, mis au point par⁹Heyduk et ses collègues, est une autre approche homogène à la mesure de l’insuline basée sur la liaison des deux anticorps distincts aux épitopes différents sur la molécule d’insuline. Les anticorps sont chaque ADN bicaténaire chimiquement lié à double avec court porte-à-faux complémentaires de l’ADN échoués unique. Liaison des anticorps à l’insuline les réunit et conduit à un double brin DNA bicaténaire. Chaque anticorps est également associé à un fluorophore donneur ou accepteur respectif, et l’association de la DNA bicaténaire regroupe ces fluorophores pour générer le transfert d’énergie de résonance Förster (FRET). Une des limites possibles de TR-TENAILLE, cependant, repose avec la frette lui-même. L’incapacité à dissiper rapidement la fluorescence de fond au cours de la réaction de la frette peut conduire à des niveaux relativement élevés de fluorescence de fond et un faible rapport signal sur bruit dans le dosage. Par conséquent, un besoin existe toujours pour un dosage fiable, robuste et rentable pour quantifier le GSIS d’une manière de haut débit.

Les progrès récents en biophysique ont abouti à l’élaboration d’un test de transfert (HTRF) fondé homogène de fluorescence résolue en temps énergie résonance. Plus précisément, alors que le transfert de l’énergie dans le dosage pourrait qualifier axée sur la frette, avec plus de précision, que HTRF s’appuie sur la luminescence énergétique résonance transfert (vu)¹⁰ qui est le transfert d’énergie non radiatif entre le donneur et l’accepteur espèces de^12,11,13. Cette distinction est importante, depuis le moment où une fluorescence ou trempe la base frette interaction est très différent qu’il est pour vu, bien que les mêmes types de déclenchement peuvent être utilisés pour le FRET et vu. En outre, l’utilisation des terres rares lanthanide cryptate composés comme l’europium ou cryptate de terbium à HTRF produit fluorescence longue demi-vie^12,14. Cela offre l’avantage unique de l’introduction d’un temps de retard (µsec) entre l’excitation du donneur et la mesure de l’émission de l’accepteur (c.-à-d., résolution temporelle assay). Ce délai permet de suffisamment de temps pour la fluorescence de fond se dissipe avant la mesure de la fluorescence d’émission accepteur. Par conséquent, l’affichage est exempt de fluorescence non spécifiques et ainsi, un rapport signal sur bruit élevé est atteint (Figure 1). En outre, le caractère homogène de HTRF élimine la nécessité d’étapes de lavage pour laver les espèces non liés, rendant le dosage bien plus rapide que ELISA ou méthodes axées sur la RIA.

Figure 1 : schéma du mécanisme de détection de l’insuline HTRF. Deux anticorps monoclonaux indépendamment générés spécifiquement reconnaître et lier à l’insuline à des sites distincts. Ces anticorps sont conjugués à l’accepteur XL665 ou le donneur de cryptate d’europium. Excitation du donneur à 337 résultats nm dans l’émission à 620 nm. Le transfert d’énergie qui en résulte provoque la XL665 émettre une longueur d’onde plus longues, 665 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’utiliser une approche axée sur les HTRF pour déterminer les niveaux de GSIS de cellules INS-1E, un bien établie insulino-sécrétrices cellules bêta dérivé rat insulinome cellule ligne¹⁵. En outre, ce test peut servir pour identifier le profil pharmacologique de régulateurs moléculaires de la sécrétion d’insuline. Nous appliquons ce dosage insuline basée sur HTRF afin d’examiner la dopamine D₂-comme la régulation des récepteurs de GSI. Croissant d’études ont révélé que la dopamine, un neurotransmetteur est un régulateur important du GSIS^{8,16,17,18,19,20, 21 , 22}. la dopamine affecte GSIS autocrine/paracrine négativement par des actions sur la dopamine D₂-comme des récepteurs (D₂, D₃, récepteurs de₄ D) exprimée à la surface de cellules pancréatiques bêta^{8 , 16 , 19}. à l’aide de ce test, nous confirmer le rôle de la dopamine comme un régulateur négatif du GSIS et démontrer que la dopamine D₂-bromocriptine agonistes du récepteur et quinpirole également réduire GSIS.

Protocol

1. INS-1E cellules : entretien et placage Maintenir les INS-1E cellules dans un incubateur à2 ˚C/5% CO 37 humidifié et cultivées avec milieu RPMI 1640 additionnée de 5 % (v/v) inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 10 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine solution, 50 µM β-mercaptoéthanol. Culture de cellules en milieu RPMI 1640 complet de 10 mL (par assiette), jusqu’à ce qu’ils atteignent la confluence de 80 à 90 %, quan…

Representative Results

Nous avons validé notre essai HTRF de l’insuline en générant une courbe standard de l’insuline à l’aide de l’insuline humaine purifiée normes de concentrations prédéfinies (Figure 2). Génération de la courbe standard nous ont permis d’extrapoler les lectures de fluorescence ratiométrique et donc à déterminer les niveaux d’insuline sécrétée en réponse aux traitements médicamenteux (Figure 2). La variat…

Discussion

Le dosage de l’insuline HTRF décrit ici vous propose un système rapid et efficace permettant de mesurer la sécrétion d’insuline d’un système de base de cellules cultivée. Parmi ses avantages les plus importants, ce test offre un signal faible bruit de fond en raison du rapport signal-bruit élevé. En outre, nous avons confirmé que le signal HTRF est stable pendant de longues périodes (> 24h)⁷. Néanmoins, comme les anticorps monoclonaux de liaison de l’insuline d’atteindre rapid…

Materials

96-well white half area plate	Greiner Bio-One	82050-042
384-well white low-volume, round-bottom plate	Corning	15100157
Insulin High Range Kit	Cisbio Bioassays	62IN1PEH	10,000 test HTRF-based insulin assay kit
PHERAstar FSX plate reader	BMG Labtech	FSX	Plate reader adapted for HTRF-based assay readings
Plate sealers	Fisher Scientific	DY992	To seal plate while antibodies incubate
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	11875-093	[+] L-glutamine
Trypsin 0.05%	Corning	25-052-CI	0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV	Without calcium and magnesium
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HEPES	Gibco	156-30-080
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
Penicillin/Streptomycin solution 100x	Corning	30-002 CT
2-mercaptoethanol	Sigma	M1348
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Dopamine hydrochloride	Sigma	8502
Bromocriptine mesylate	Tocris	427
(-)-Quinpirole hydrochloride	Tocris	1061
Bovine Serum Albumin	Calbiochem	12659
Poly-L-Lysine	Sigma	P4832
Glucose	Sigma	G7021
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma	276855