Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo
Summary
C’è una carenza significativa donatore di fegato, e i criteri per i donatori di fegato sono stati ampliati. Perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato sviluppato per valutare e modificare la funzione dell’organo. Questo studio dimostra un modello del ratto di NEVLP e verifica la capacità di pegylated-catalasi, per attenuare la lesione di conservazione del fegato.
Abstract
C’è una scarsità significativa dei documenti non autografo del fegato per i trapianti, e in risposta ai criteri del donatore sono stati ampliati. Di conseguenza, perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare la funzione dell’organo. NEVLP ha molti vantaggi rispetto ai ipotermico e subnormothermic perfusione tra cui ha ridotto la lesione di conservazione, il ripristino della funzione normale dell’organo in condizioni fisiologiche, valutazione delle prestazioni di organo e come piattaforma per la riparazione dell’organo , ritocco e la modifica. Modelli NEVLP sia murini che suini sono stati descritti. Dimostriamo un modello del ratto di NEVLP e utilizzare questo modello per mostrare una delle sue importanti applicazioni — l’uso di una molecola terapeutica aggiunta al perfusato del fegato. Catalasi è un organismo saprofago di ossigeno reattive endogene specie (ROS) e ha dimostrata di diminuire ischemia-reperfusion dentro l’occhio, il cervello e il polmone. PEGilazione ha dimostrato di catalasi all’endotelio di destinazione. Qui, abbiamo aggiunto pegilato-catalasi (PEG-CAT) al perfusato base e dimostrato la sua capacità di mitigare la ferita di conservazione del fegato. Un vantaggio del nostro modello NEVLP roditore è che è poco costoso rispetto ai modelli animali più grandi. Una limitazione di questo studio è che non include attualmente post-aspersione trapianto del fegato. Di conseguenza, stima della funzione del post-trapianto dell’organo non può essere fatta con certezza. Tuttavia, il modello di trapianto di fegato del ratto è ben consolidato e certamente potrebbe essere utilizzato in combinazione con questo modello. In conclusione, abbiamo dimostrato un modello NEVLP poco costoso, semplice e facilmente replicabile utilizzando ratti. Applicazioni di questo modello possono includere test perfusati romanzo e additivi di perfusato, software progettato per la valutazione dell’organo test ed esperimenti progettati per riparare organi.
Introduction
Ci sono 14.578 pazienti in lista d’attesa per trapianto di fegato e circa 7.000 trapianti vengono eseguiti per anno1,2. In risposta a questa carenza significativa dei donatori, hanno ampliato i criteri per i donatori di fegato; Questi sono spesso indicati come organi marginali o donatori di criteri estesi e sono tenuti a svolgere meno bene dopo trapianto di allotrapianti di criteri standard, con più alti tassi di disfunzione dell’innesto primario e funzione di ritardo dell’innesto3, 4,5,6. Di conseguenza, NEVLP è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare organo funzione6,7. Abbiamo progettato un modello del ratto di NEVLP e utilizzato questo modello per illustrare una delle sue potenziali applicazioni importanti – la sperimentazione di additivi di nuove molecole di perfusato del fegato.
NEVLP è stata valutata in murino (ratto) sia modelli porcine, così come in organi umani scartati6,8,9. I risultati delle prime prove umane di NEVLP sono stati anche recentemente pubblicati10. Sebbene l’aspersione ipotermica macchina chiaramente è diventato lo standard per la conservazione del rene, la temperatura alla quale macchina del fegato dovrebbe verificarsi perfusione è ancora discutibile. NEVLP ha proposti molti vantaggi rispetto ai ipotermico e perfusione subnormothermic. Questi includono lesioni ridotta conservazione, il ripristino della funzione normale dell’organo in condizioni fisiologiche, la capacità di valutare le prestazioni dell’organo e come una piattaforma per la riparazione dell’organo, ritocco e modifica7,11, 12,13,14,15,16,17.
Un numero significativo di studi siano stato completato utilizzando modelli NEVLP suine. Anche se questi modelli sono comparativamente poco costosi quando considerando modelli utilizzando scartato organi umani o test clinici umani, essi sono molto costosi rispetto al nostro piccolo animale NEVLP modello. Una componente significativa della per esperimento costo è il perfusato. Siamo in grado di completare un’aspersione di 4h con 300 mL di perfusato ad un costo relativamente basso. Inoltre, il costo di piccoli animali tra cui ratti è molto basso rispetto al costo dei suini.
In confronto ad altri modelli di NEVLP nel ratto, il modello presentato qui è relativamente semplice da implementare e ha una vasta gamma di applicazioni. Il circuito di perfusione può essere visto nella Figura 1. Il perfusato inizia nel perfusato serbatoio (1), che è un contenitore rivestito di acqua. Perfusato è tirato dal serbatoio di una pompa a rulli (2) e spinto in un windkessel (3) e poi l’ossigenatore (4). L’ossigenatore è impostata per gas controcorrente e flusso di perfusato per fornire uno scambio gas di massima. Il perfusato quindi procede a un riscaldamento della bobina (5) all’interno della camera di perfusione per assicurarsi che è a temperatura fisiologica, e un gorgogliatore (6) per prevenire l’aspersione di bolle d’aria ci sono pre-organo (7) e post-organo (8) porte di campione, che consentono il perfusato essere Campionati. Il perfusato poi entra il fegato attraverso la cannula della vena portale. La cannula della vena portale è collegata a un monitor di pressione che mappa i valori sul software di raccolta dati. Il perfusato poi esce il fegato attraverso la cannula IVC e sfocia il blocco equalizzatore di pressione (9). Infine, il perfusato è tirato dal blocco pressione indietro attraverso la pompa roller e svuotato nel serbatoio. Questo modello include aspersione continua alla vena portale e lascia fuori il flusso pulsatile per l’arteria epatica e la dialisi usati in alcuni altri modelli, ognuno dei quali richiede un circuito separato e aggiuntivo, ma in precedenza è stato dimostrato per non essere richiesto9,13.
Per esplorare l’aggiunta di una nuova molecola terapeutica al perfusato, abbiamo scelto l’enzima catalasi. Catalasi è un organismo saprofago endogeno di ROS che fa parte del meccanismo di difesa interno cellule per mitigare gli effetti di ROS18. Espressione di catalasi è aumentata di ischemia epatica riperfusione pregiudizio19. Sperimentale aggiunta della catalasi è stata dimostrata per diminuire ischemia-reperfusion dentro l’occhio, il cervello e il polmone20,21,22,23,24. PEGilazione ha dimostrato di destinazione catalasi per l’endotelio e aiuto nell’assorbimento della catalasi in cellule endoteliali25. PEG-CAT è stato somministrato per via sistemica con limitata efficacia nel ridurre la lesione di ischemia-riperfusione epatica; Tuttavia, abbiamo supposto che l’aggiunta di CHE PEG-CAT ad un circuito di perfusione d’organo isolato porterebbe a una migliore risultati26,27,28. Qui, si aggiunge il PEG-CAT alla nostra base perfusato e dimostrare la propria capacità ridurre lesioni conservazione del fegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
C’è una scarsità significativa dei documenti non autografo del fegato per i trapianti e in risposta i criteri dei donatori sono stati espansi1,2,3,4,5. A causa della scarsità di donatori, NEVLP è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare organo funzione6,7. Abbiamo progettato un mod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH T32AI 106704-01A1 e dal fondo di Flesch T. per trapianto dell’organo, aspersione, ingegneria e rigenerazione presso la Ohio State University.
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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