诱导多潜能干细胞源性肝细胞的家族性高胆固醇血症人肝嵌合小鼠模型
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以生成一个人肝嵌合体小鼠家庭高胆固醇血症使用人诱导的多潜能干细胞源性肝细胞模型。这是一个有价值的模型来测试新的治疗高胆固醇血症。
Abstract
家族性高胆固醇血症 (FH) 主要是由低密度脂蛋白受体 (LDLR) 突变引起的, 由于血液中 ldl 胆固醇 (ldl C) 明显升高, 导致早期心血管疾病的风险增加。他汀类药物是治疗 FH 和其他类型高胆固醇血症的第一行降脂药, 但是新的方法正在出现, 特别是 PCSK9 抗体, 现在正在临床试验中进行测试。为了探索一种新的治疗方法的 FH, 无论是新药或新剂型, 我们需要适当的体内模型。然而, 与人类相比, 脂代谢剖面的差异是可利用的 FH 动物模型的关键问题.为了解决这个问题, 我们用跳频诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的肝细胞 (iHeps) 生成了一种人肝嵌合小鼠模型。我们使用Ldlr–//Rag2///Il2rg (LRG) 小鼠, 以避免对移植的人类细胞免疫排斥, 并评估 Ldlr 缺乏 iHeps 在 Ldlr 空背景下的效果。移植的 FH iHeps 可以在人白蛋白染色的基础上重新填充5-10% 的 LRG 小鼠肝脏。此外, 嫁接 iHeps 反应降脂药物和概括临床观察, 提高疗效的 PCSK9 抗体相比, 他汀。因此, 我们的人肝嵌合体模型可用于新疗法对 FH 的临床前试验。使用相同的协议, 类似的人肝嵌合体小鼠的其他 FH 遗传变异, 或突变相对应的其他遗传性肝病, 也可能产生。
Introduction
低密度脂蛋白受体 (LDLR) 在血液中捕获 ldl 胆固醇 (ldl C) 来调节肝脏中的胆固醇合成。LDLR 基因突变是家族性高胆固醇血症 (FH)1的最常见病因。他汀类药物历来是治疗 FH 和其他类型的高胆固醇血症 (遗传性或后天) 的第一行药。他汀类药物抑制 3-羟基 3-methylglutaryl 辅酶 A 还原酶, 降低胆固醇合成在肝脏2。此外, 他汀类药物增加了肝细胞表面的 LDLR 水平, 促进血浆 LDL-C 清除。然而, 对他汀类药物治疗的一个主要告诫是, 它们同时诱发 proprotein convertase 枯草杆菌/合心 9 (PCSK9) 的表达, 这种酶结合 LDLR 促进其降解3。这一效应是对许多患者所观察到的对他汀类药物的反应不足甚至无效的原因。研究这种机制出人意料地导致发现一种治疗高胆固醇血症的替代方法。FDA 最近批准的 PCSK9 抗体目前正在临床试验中使用, 表现出更高的疗效和耐受性优于他汀类药物4。PCSK9 抗体的成功也意味着可能有其他的治疗可能性来调节 LDLR 降解通路 (除了 PCSK9) 在高胆固醇血症患者。同样, 有兴趣开发新的抑制剂 PCSK9 除抗体以外, 例如, siRNA 寡核苷酸5。
为了测试 FH 和一般其他类型的高胆固醇血症的新疗法, 适当的体内模型是必要的。当前体内模型的一个主要问题, 主要是老鼠6和兔子7, 是他们与人类的生理差异。关键的是, 这些问题包括不同的脂代谢剖面。人类肝脏嵌合动物的生成8可能有助于克服这一警告。人肝嵌合体小鼠是一种 “人性化” 的小鼠, 其肝填充与人肝细胞, 如原发性人肝细胞 (pHH)9。pHH 的一个问题是, 它们不能在体内扩张, 在隔离时迅速失去功能, 而且是有限的来源。替代 pHH 是利用诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生肝细胞 (iHeps)10。值得注意的是, iPSCs 是有耐心的, 可以无限期地增长, 所以 iHeps 可以根据需求生产, 这是比新鲜 pHH 的一个显著优势。此外, iPSCs 也可以很容易地基因工程与设计师核酸纠正或引入突变的等基因系背景, 以允许更忠实的比较11。
人肝嵌合体小鼠与嫁接 pHH 显示相似的人在肝脏代谢概况, 药物反应和易感性的肝炎病毒感染12。这使它们成为研究体内高脂血症的良好模型。最广泛使用的鼠标模型是基于 Rag2////// Il2rg-/- (悬浮角速度陀螺仪) 小鼠13和转基因小鼠8, 其中多达95% 的小鼠肝脏可以被 pHH 取代。有趣的是, 最近的一份报告描述了一个人跳肝嵌合小鼠 (基于悬浮角速度陀螺仪) 与 pHH 的患者携带纯合LDLR突变14。在这个模型中, 填充人肝细胞没有功能性 LDLR, 但残留的小鼠肝细胞, 从而减少了在体内检测的药物依赖于 LDLR 途径的效用。
在这里, 我们报告一个详细的协议, 根据我们最近出版的工作15为嫁接 FH iHeps 进入Ldlr-//Rag2//Il2rg-/ (LRG) 小鼠肝脏。这种人肝嵌合体小鼠是有用的模拟 FH 和执行药物测试在体内.
Protocol
Representative Results
Discussion
以前在啮齿目动物中使用 iHeps 的研究证实, 它们是研究遗传性肝病17的有效方法。为了进一步扩大这种技术的使用, 因为目前的 fh 动物模型是不优的, 我们嫁接 fh iHeps 成 LRG 小鼠, 并表明嫁接LDLR +/或异型LDLR突变的 FH iHeps 可以减少小鼠血浆 LDL C 水平并对体内降脂药物作出反应。
我们的协议中有3个关键步骤使用 iHeps 生成人跳肝嵌合体小鼠:<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了深圳市科技委员会基础研究计划 (JCYJ20150331142757383)、中国科学院战略优先研究计划 (XDA16030502)、香港研究资助局主题研究项目的支持。计划 (T12-705/11)、香港特别行政区研究资助局和中国国家自然科学基金 (N-HKU730/12 及 81261160506) 合作计划, 广东自然科学研究小组项目基金会 (2014A030312001), 广州科技项目 (201607010086), 广东省科技项目 (2016B030229007 和 2017B050506007)。
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
