Un modello di Mouse chimerici del fegato umano di ipercolesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello del mouse chimerici del fegato umano di hypercholesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Si tratta di un modello valido per testare nuove terapie per ipercolesterolemia.
Abstract
Ipercolesterolemia familiare (FH) è principalmente causata da mutazioni del recettore (LDLR) di lipoproteina a bassa densità e si traduce in un aumentato rischio di malattia cardiovascolare precoce a causa di profonda elevazione del colesterolo LDL (LDL-C) nel sangue. Le statine sono la prima linea di farmaci ipolipemizzanti per il trattamento di altri tipi di ipercolesterolemia e FH, ma stanno emergendo nuovi approcci, in particolari anticorpi di PCSK9, che sono ora in fase di sperimentazione in studi clinici. Per esplorare nuovi approcci terapeutici per FH, nuovi farmaci o nuove formulazioni, abbiamo bisogno del caso in vivo modelli. Tuttavia, le differenze nei profili del lipido metabolica rispetto agli esseri umani sono un problema chiave dei modelli animali disponibili di FH. Per risolvere questo problema, abbiamo generato un modello di topo chimerico del fegato umano utilizzando cellule staminali pluripotenti FH indotta (iPSC)-derivato epatociti (iHeps). Abbiamo usato i topi/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) per evitare il rigetto immunitario delle cellule umane trapiantate e per valutare l’effetto di LDLR-iHeps carente in un LDLR null sfondo. IHeps FH trapiantati potrebbe ripopolare 5-10% del fegato del topo LRG basato sulla macchiatura di albumina umana. Inoltre, la iHeps engrafted ha risposto ai farmaci ipolipemizzanti e ricapitolato osservazioni cliniche di efficacia aumentata di PCSK9 anticorpi rispetto alle statine. Nostro modello chimerico del fegato umano potrebbe così essere utile per i test preclinici di nuove terapie per FH. Utilizzando il protocollo stesso, topi chimerici del fegato umani simili per altre varianti genetiche FH, o mutazioni corrispondenti alle altre malattie ereditarie del fegato, può essere generato anche.
Introduction
Del ricevitore della lipoproteina a bassa densità (LDLR) acquisisce il colesterolo di LDL (LDL-C) nel sangue di modulare la sintesi del colesterolo nel fegato. Le mutazioni nel gene LDLR sono la causa più frequente di ipercolesterolemia familiare (FH)1. Le statine sono state tradizionalmente la prima linea del farmaco per il trattamento di FH e altri tipi di ipercolesterolemia (ereditato o acquisito). Le statine inibiscono 3-idrossi-3-methylglutaryl-coenzyme una riduttasi per abbassare la sintesi del colesterolo nel fegato2. Inoltre, le statine aumentano i livelli LDLR sulla superficie dell’epatocita per promuovere del plasma LDL-C liquidazione. Tuttavia, un avvertimento importante del trattamento con statine è che simultaneamente inducono l’espressione di proteina convertasi subtilisin/hexin 9 (PCSK9), un enzima che si lega al LDLR per promuovere la sua degradazione3. Questo effetto è responsabile per la risposta insufficiente o anche null alle statine osservate in molti pazienti. Studiando questo meccanismo ha, inaspettatamente, ha portato alla scoperta di un modo alternativo per il trattamento di ipercolesterolemia. PCSK9 anticorpi recentemente approvati dalla FDA sono attualmente utilizzati negli studi clinici e mostrano più alta efficacia e migliore tolleranza quanto le statine4. Il successo di PCSK9 anticorpi implica anche che ci possono essere altre possibilità terapeutiche di modulare la via di degradazione di LDLR (oltre PCSK9) in pazienti con ipercolesterolemia. Allo stesso modo, c’è interesse nello sviluppo di nuovi inibitori di PCSK9 diverso da anticorpi, ad esempio, siRNA oligos5.
Per testare nuove terapie per FH e in generale qualsiasi altro tipo di ipercolesterolemia, appropriato in vivo modelli sono necessari. Un grave problema di corrente in vivo modelli, per lo più topi6 ed i conigli7, sono loro differenze fisiologiche con gli esseri umani. Fondamentalmente, questi problemi includono un profilo metabolico dei lipidi differenti. La generazione di animali chimerici del fegato umano8 potrebbe aiutare a superare questo avvertimento. Il mouse chimerico del fegato umano è un tipo di mouse “umanizzato” con il suo fegato ripopolato con epatociti umani, ad esempio, epatociti umani primari (pHH)9. Un problema con pHH è che non possono essere espanse ex vivo, rapidamente perdono la loro funzione all’isolamento, e sono una fonte limitata. Un’alternativa a pHH è l’uso di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)-derivato di epatociti (iHeps)10. In particolare, iPSCs sono paziente-specifici e possono essere coltivate all’infinito, così iHeps può essere prodotta su richiesta, che è un vantaggio significativo rispetto pHH fresco. Inoltre, iPSCs può anche essere facilmente geneticamente con design nucleasi di correggere o introdurre mutazioni in un background isogeniche per consentire più fedele confronti11.
Umano del fegato mouse chimerici con engrafted pHH mostrano somiglianze agli esseri umani in profili metabolici del fegato, le risposte farmacologiche e suscettibilità all’ infezione di epatite virus12. Questo li rende un buon modello per studiare iperlipidemia in vivo. I modelli di mouse più ampiamente usati sono basati il/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (RFG) del mouse13 e l’uPA topo transgenico8, in cui fino al 95% del mouse fegato può essere sostituito da pHH. È interessante notare che, un recente rapporto descritto un umano FH del fegato chimerico topo (basato sul mouse RFG) con pHH da un paziente che trasporta una mutazione di omozigoti LDLR 14. In questo modello, gli epatociti umani ripopolati non avevano nessun LDLR funzionale, ma gli epatociti residua del mouse fatto, riducendo così l’utilità per l’esecuzione di test in vivo di farmaci basandosi sulla via di LDLR.
Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato basato sul nostro lavoro recentemente pubblicato15 per capacità di integrazione iHeps FH in fegato del topo/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG). Questo mouse chimerico del fegato umano è utile per la modellazione FH ed esecuzione di test anti-droga in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi precedenti utilizzando iHeps in roditori hanno confermato che sono un modo efficace per studiare malattie ereditate del fegato17. Ulteriormente espandere l’uso di questa tecnologia e perché attuali modelli animali di FH sono suboptimali, abbiamo engrafted FH iHeps in topi LRG e ha dimostrato che il engrafted LDLR + /- o eterozigoti LDLR-mutato FH iHeps può ridurre il livello di LDL-C del plasma di topi e rispondere alla riduzione dei lipidi droga in vivo.
…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Shenzhen scienza e tecnologia del Consiglio programma Basic Research (JCYJ20150331142757383), programma di ricerca strategico prioritario dell’Accademia cinese delle scienze (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Consiglio tema basato su ricerca Schema (T12-705/11), programma di cooperazione del Consiglio di sovvenzioni di ricerca della regione amministrativa speciale di Hong Kong e la Fondazione nazionale di scienze naturali di Cina di (N-HKU730/12 e 81261160506), progetto di Team di ricerca di scienze naturali di Guangdong Foundation (2014A030312001), Guangzhou Science e Technology Program (201607010086) e nella provincia del Guangdong scienza e tecnologia programma (2016B030229007 e 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
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