En familiær hyperkolesterolemi menneskelige leveren Chimeric musemodell med indusert Pluripotent Stamcelle-avledet hepatocytter
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å generere en menneskelig leveren chimeric musemodell familiær hyperkolesterolemi med menneskelige indusert pluripotent Stamcelle-avledet hepatocytter. Dette er en verdifull modell for å teste nye behandlingsformer for hyperkolesterolemi.
Abstract
Familiær hyperkolesterolemi (FH) er hovedsakelig forårsaket av lav tetthet lipoprotein reseptor (LDLR) mutasjoner og resulterer i en økt risiko for tidlig kardiovaskulær sykdom på grunn av merket heving av LDL kolesterol (LDL-C) i blodet. Statiner er den første linjen i lipidsenkende legemidler for behandling av FH og andre typer hyperkolesterolemi, men nye tilnærminger er nye, i bestemt PCSK9 antistoffer, som nå blir testet i kliniske forsøk. For å utforske nye behandlingsmetoder for FH, nye stoffer eller nye formuleringer, trenger vi passende i vivo modeller. Forskjeller i lipid metabolske profiler i forhold til mennesker er imidlertid et viktig problem av tilgjengelige dyr modeller av FH. For å løse dette problemet, vi har generert en menneskelig leveren chimeric musemodell med FH indusert pluripotent stilk cellen (iPSC)-avledet hepatocytter (iHeps). Vi brukte/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) mus å unngå uimottakelig avvisning av transplantert menneskelige celler og å vurdere effekten av LDLR-mangelfull iHeps i en LDLR null bakgrunn. Transplantert FH iHeps kunne gjenbefolke 5-10% av LRG musen leveren basert på menneskelige albumin flekker. Videre engrafted iHeps svart lipidsenkende legemidler og recapitulated kliniske observasjoner av økt effekt av PCSK9 antistoffer sammenlignet statiner. Våre menneskelige leveren chimeric modellen kan dermed være nyttig for prekliniske testing av nye behandlingsformer å FH. Bruke samme protokoll, ligner menneskelige leveren chimeric mus for andre FH genetisk varianter eller mutasjoner tilsvarer andre arvede leversykdom kan også genereres.
Introduction
Lav tetthet lipoprotein reseptor (LDLR) fanger LDL kolesterol (LDL-C) i blodet å modulere syntesen av kolesterol i leveren. Mutasjoner i genet LDLR er den hyppigste årsaken til familiær hyperkolesterolemi (FH)1. Statiner har tradisjonelt vært den første linjen i medisiner til å behandle FH og andre typer hyperkolesterolemi (arvet eller ervervet). Statiner hemme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym en reduktase å senke kolesterol syntese i leveren2. I tillegg øke statiner LDLR nivåene på hepatocyte overflaten å markedsføre plasma LDL-C klaring. En stor påminnelse behandling med statiner er imidlertid at de samtidig induserer uttrykk for proprotein konvertasene subtilisin/hexin 9 (PCSK9), et enzym som binder til LDLR å fremme sin fornedrelse3. Denne effekten er ansvarlig for tilstrekkelig eller selv null svaret statiner observert i mange pasienter. Studere denne mekanismen har uventet førte til oppdagelsen av en alternativ måte å behandle hyperkolesterolemi. PCSK9 antistoffer nylig godkjent av FDA for tiden blir brukt i kliniske forsøk og vise høyere effekt og bedre toleranse enn statiner4. Suksessen til PCSK9 antistoffer innebærer også at det kan være andre terapeutiske muligheter å modulere LDLR fornedrelse veien (foruten PCSK9) hos pasienter med hyperkolesterolemi. Tilsvarende er det interesse i å utvikle nye hemmere av PCSK9 enn antistoffer, for eksempel siRNA oligos5.
For å teste nye behandlingsformer for FH og generelt andre typen hyperkolesterolemi, er riktig i vivo modeller nødvendig. Et stort problem for gjeldende i vivo modeller, hovedsakelig mus6 og kaniner7, deres fysiologiske forskjeller med mennesker. Avgjørende, inkluderer disse problemene en annen lipid metabolske profil. Generering av menneskelig leveren chimeric dyr8 kan bidra til å overvinne denne påminnelse. Menneskelige leveren chimeric musen er en “humanized” mus med sin lever på nytt med menneskelige hepatocytter, for eksempel primære menneskelige hepatocytter (pHH)9. Et problem med pHH er at de ikke kan utvidet ex vivo, raskt mister sin funksjon på isolasjon, og er en begrenset kilde. Et alternativ til pHH er bruk av indusert pluripotent stamceller (iPSC)-avledet hepatocytter (iHeps)10. Spesielt iPSCs er pasient-spesifikk og kan dyrkes på ubestemt tid, slik at iHeps kan produseres på forespørsel, som er en betydelig fordel over ferske pHH. Videre kan iPSCs også være enkelt genetisk konstruert med designer nucleases eller introdusere mutasjoner i en isogenic bakgrunn å tillate mer trofast sammenligninger11.
Menneskelige leveren chimeric mus med engrafted pHH vise likheter til mennesker i leveren metabolske profiler, narkotika svar og mottakelighet for hepatitt virus infeksjon12. Dette gjør dem en god modell å studere hyperlipidemi i vivo. Den mest brukte musen modeller er basert på/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (FRG) musen13 og uPA transgene musen8, i opptil 95% av musen leveren kan erstattes av pHH. Interessant beskrevet en fersk rapport en menneskelig FH leveren chimeric mus (basert på FRG musen) med pHH fra en pasient med en homozygous LDLR mutasjon14. I denne modellen, de repopulated menneskelige hepatocytter hadde ingen funksjonell LDLR, men gjenværende musen hepatocytter, dermed redusere verktøyet til å utføre i vivo testing av narkotika stole på den LDLR sti.
Vi rapporterer her en detaljert protokoll basert på våre nylig publisert arbeid15 for engrafting FH iHeps inn i/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) musen leveren. Denne menneskelige leveren chimeric musen er nyttig for modellering FH og utføre narkotikatesting i vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere studier ved hjelp av iHeps i Red har bekreftet at de er en effektiv måte å studere arvet leversykdommer17. Ytterligere utvide bruken av denne teknologien og fordi gjeldende FH dyremodeller suboptimal, vi engrafted FH iHeps i LRG mus og viste at det engrafted LDLR +/- eller heterozygote LDLR-mutert FH iHeps kan redusere mus plasma LDL-C nivå og svare på lipidsenkende legemidler i vivo.
Det er 3 avgjørende skritt i våre protokoll…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Shenzhen vitenskap og teknologi Council grunnleggende forskningsprogram (JCYJ20150331142757383), strategiske prioritet Research Program av det kinesiske vitenskapsakademi (XDA16030502), Hong Kong Research Grant råd tema basert forskning Ordningen (T12-705/11), Samarbeidsprogrammet av tilskudd forskningsråd Hongkong spesiell administrativ Region og National Natural Science Foundation av Kina (N-HKU730/12 og 81261160506) Team forskningsprosjekt Guangdong naturvitenskapen Foundation (2014A030312001), Guangzhou vitenskap og teknologi Program (201607010086), og Guangdong provinsen vitenskap og teknologi Program (2016B030229007 og 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
