Модель человека печени химерных мыши семейной гиперхолестеринемией, с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов
Summary
Здесь мы представляем протокол для создания человеческой печени химерных мыши модели семейной гиперхолестеринемией, используя человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов. Это является полезной моделью для тестирования новых терапий для гиперхолестеринемии.
Abstract
Семейной гиперхолестеринемией (FH) в основном вызвано мутациями липопротеинов низкой плотности рецептора (LDLR) и приводит к повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний раннего начала из-за заметное повышение ЛПНП в крови холестерина (LDL-C). Статины являются первой линией гиполипидемические препараты для лечения FH и другие виды гиперхолестеринемии, но появляются новые подходы, в частности PCSK9 антител, которые в настоящее время проходит испытания в клинических испытаниях. Изучить новые терапевтические подходы для FH, новых лекарств или новых формулировок, мы должны надлежащим в естественных условиях модели. Однако различия в метаболические профили липидов, по сравнению с людьми являются ключевой проблемой доступных животных моделей FH. Для решения этой проблемы, мы породили модель человеческой печени химерных мыши, с помощью FH индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)-производных гепатоцитов (iHeps). Мы использовали/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) мышах, чтобы избежать иммунной неприятие трансплантированных человеческих клеток и для оценки эффекта LDLR-дефицит iHeps в LDLR null фон. Пересаженные FH iHeps может населить 5-10% печени мыши LRG основе человеческого альбумина пятнать. Кроме того прижившимися iHeps ответил гиполипидемические препараты и резюмировалась клинические наблюдения повышенной эффективности PCSK9 антител, по сравнению с статины. Наши человеческой печени химерных модель таким образом может быть полезным для доклинических испытаний новых терапий для FH. Используя тот же протокол, аналогичных человеческой печени химерных мышей для других генетических вариантов FH или мутации, соответствующий других наследственных заболеваний печени, также могут быть созданы.
Introduction
Рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR) захватывает LDL холестерина (LDL-C) в крови, чтобы модулировать синтез холестерина в печени. Мутации в гене LDLR являются наиболее частой причиной семейной гиперхолестеринемией (FH)1. Статины традиционно первая линия препаратов для лечения FH и другие виды гиперхолестеринемии (унаследованные или приобретенных). Статины препятствовать 3-гидрокси-3-methylglutaryl кофермент редуктазы снизить синтез холестерина в печени2. Кроме того статины увеличить уровень LDLR на поверхности гепатоцитов содействовать плазмы LDL-C разминирование. Однако основных предостережение лечения статинами является, что они одновременно стимулировать выражение proprotein конвертазы Субтилизин/ОА 9 (PCSK9), фермент, который привязывается к LDLR для содействия ее деградации3. Этот эффект отвечает за недостаточное или даже null ответ на статинов у многих пациентов. Изучая этот механизм неожиданно, привело к открытию альтернативный способ лечения гиперхолестеринемии. PCSK9 антитела, недавно утвержденных FDA в настоящее время используется в клинических испытаниях и показать более высокой эффективности и лучшего терпимости чем статины4. Успех PCSK9 антител также подразумевает, что могут существовать другие терапевтические возможности для модуляции путь деградации LDLR (кроме PCSK9) у больных с гиперхолестеринемией. Аналогичным образом есть интерес к разработке новых ингибиторов PCSK9 помимо антител, например, siRNA oligos5.
Для тестирования новых терапий для FH и вообще любой другой тип гиперхолестеринемии, необходимы соответствующие в естественных условиях модели. Основной проблемой текущего в естественных условиях модели, основном мышей6 и кроликов7, являются их физиологические различия с людьми. Самое главное эти проблемы включают различные липидного метаболизма профиля. Поколение человеческой печени животных химерных8 может помочь преодолеть этот нюанс. Человеческой печени химерных мышь — это тип «гуманизированные» мышь с ее печень, заселена с человека гепатоцитов, например, основного человеческого гепатоцитов (ПГГ)9. Проблема с ПГГ состоит в том, что они не могут быть расширенной ex vivo, быстро теряют свою функцию после изоляции, и ограниченным источником. Альтернативой ПГГ является использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)-производных гепатоцитов (iHeps)10. Примечательно iPSCs конкретного пациента и может выращиваться на неопределенный срок, поэтому iHeps могут быть изготовлены по требованию, которая является значительным преимуществом над свежие ПГГ. Кроме того iPSCs также может быть легко генной инженерии с конструктора nucleases исправления или вводить мутации в isogenic фон, чтобы позволить более верным сравнения11.
Человеческой печени химерных мышь с прижившимися ПГГ показать сходство с людьми в печени метаболические профили, наркотиков ответы и восприимчивость к инфекции вируса гепатита12. Это делает их хорошей моделью для изучения гиперлипидемии в естественных условиях. Наиболее широко используемый мыши модели основаны на/фа– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (ФРГ) мыши13 и УПА трансгенные мыши8, в котором до 95% мыши печени могут быть заменены ПГГ. Интересно, что недавний доклад описал человека FH печени химерных мышь (основанный на мыши ФРГ) с ПГГ от пациента, перевозящих гомозиготных мутации LDLR 14. В этой модели repopulated человека гепатоцитов без функциональных LDLR, но остаточный мыши гепатоцитов сделал, тем самым уменьшая утилита для выполнения в vivo тестирование препаратов, опираясь на LDLR пути.
Здесь мы приводим подробный протокол, основанный на наших недавно опубликованной работе15 за отлаживание FH iHeps в/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) мыши печени. Эта человеческой печени химерных мышь является полезным для моделирования FH и выполнения тестирования на наркотики в vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие исследования с использованием iHeps грызунов подтвердили, что они являются эффективным способом для изучения наследственных заболеваний печени17. Для дальнейшего расширения использования этой технологии и потому что текущих FH Животные модели субоптимальные, мы …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Shenzhen науки и технологии Совета основной исследовательской программы (JCYJ20150331142757383), стратегической приоритетной исследовательской программы Китайской академии наук (XDA16030502), Гонконг грант Совета темы на основе исследования Схема (T12-705/11), программа сотрудничества Фонда Национальный природный науки Китая (N-HKU730/12 и 81261160506), команда исследовательского проекта Гуандун естественных наук и научно-исследовательских грантов Совета Специального административного района Гонконг Фонд (2014A030312001), Гуанчжоу науки и технологий программы (201607010086) и провинции Гуандун науки и технологии программы (2016B030229007 и 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
