İndüklenmiş Pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak ailesel hiperkolesterolemi insan karaciğer Chimeric fare modeli
Summary
Burada, ailesel hiperkolesterolemi insan indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak bir insan karaciğer chimeric fare modeli oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yeni tedaviler hiperkolesterolemi için test etmek için değerli bir modeldir.
Abstract
Ailesel hiperkolesterolemi (FH) çoğunlukla düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör (LDLR) mutasyonlar neden olur ve kan LDL kolesterol (LDL-C) işaretli yükselmesi nedeniyle erken başlangıçlı kardiyovasküler hastalık riski sonuçları. Statinler, lipid düşürücü ilaçlar FH ve diger hiperkolesterolemi tedavi için ilk satırı olmakla birlikte, yeni yaklaşımlar, şimdi klinik denemeler test edilen belirli PCSK9 antikor olarak ortaya çıkıyor. Yeni tedavi yaklaşımları FH, yeni ilaçlar ya da yeni formülasyonları, keşfetmek için in vivo modelleri uygun. Ancak, farklar insanlara göre lipid metabolik profilleri FH. hayvan mevcut modellerin önemli bir sorun Bu sorunu gidermek için indüklenen FH pluripotent kök hücre (IPSC) kullanarak bir insan karaciğer chimeric fare modeli üretilip-tetkikine (iHeps) türetilmiş. Biz/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) fareler transplante insan hücreleri bağışıklık ret önlemek için ve LDLRetkisini değerlendirmek için kullanılır-eksik iHeps bir LDLR içinde null arka plan. Transplante FH iHeps insan albumini boyama dayalı LRG fare karaciğer % 5-10’u yeniden doldurmanız. Ayrıca, engrafted iHeps lipid düşürücü ilaçlara yanıt ve artan PCSK9 antikorlar statinler için karşılaştırıldığında etkinliğinin klinik gözlemleri recapitulated. İnsan karaciğer chimeric modelimiz böylece FH yeni tedavilere preklinik sınamak için yararlı olabilir. Diğer FH genetik varyantların veya devralınan diğer karaciğer hastalıkları için karşılık gelen mutasyonlar için aynı iletişim kuralını, benzer insan karaciğer chimeric fare kullanılarak da oluşturulabilir.
Introduction
Düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör (LDLR) LDL kolesterol (LDL-C) kan kolesterol sentezi karaciğer modüle yakalar. LDLR gen mutasyonlar ailesel hiperkolesterolemi (FH)1en sık nedenidir. Statinler geleneksel FH ve diğer tip-in (kalıtsal veya edinsel) hiperkolesterolemi tedavi için ilaç ilk satırı olmuştur. Statinler 3-hidroksi-3-methylglutaryl-koenzim kolesterol sentezi karaciğer2düşürmek için bir redüktaz inhibe. Ayrıca, Statinler hepatosit yüzeyindeki plazma LDL-C izni teşvik LDLR düzeylerini artırmak. Ancak, tedavi statinler ile büyük bir ihtar aynı anda proprotein konvertaz subtilisin/hexin 9 (PCSK9), LDLR için onun yıkımı3tanıtmak için bağlar bir enzim ifade ikna etmek olduğunu. Bu etki çok hastalarda gözlenen statinler yetersiz veya bile boş yanıt sorumludur. Bu mekanizma eğitim beklenmedik bir şekilde, hiperkolesterolemi tedavi için alternatif bir yol bulma için yol açmıştır. Yakın zamanda FDA tarafından onaylanmış PCSK9 antikorlar klinik çalışmalarda kullanılmakta olan ve daha yüksek etkinlik ve Statinler4‘ ten daha iyi tolerans göstermek. PCSK9 antikor başarısı Ayrıca hiperkolesterolemi olan hastalarda (PCSK9) yanında LDLR düşmesine yol modüle için diğer tedavi olanakları olabilir anlamına gelir. Benzer şekilde, PCSK9 yeni inhibitörleri antikorlar, örneğin, siRNA oligos5dışında gelişmekte olan ilgi olduğunu.
FH ve hiperkolesterolemi genel olarak başka herhangi bir tür için yeni tedaviler sınamak için uygun vivo içinde modelleri gereklidir. Geçerli vivo içinde büyük bir sorun modelleri, çoğunlukla fare6 ve7, tavşan insanlarla kendi fizyolojik farklılıklar vardır. En önemlisi, bu sorunlar farklı lipid metabolizma profili içerir. İnsan karaciğer chimeric hayvanlar8 nesil bu uyarı üstesinden yardımcı olabilir. İnsan karaciğer chimeric fare insan tetkikine, örneğin, birincil insan tetkikine (pHH)9depolanmışsa, karaciğer ile “insanlaşmış” fare türüdür. Onlar hızlı bir şekilde genişletilmiş ex vivo, olamaz pHH ile ilgili bir sorun olduğunu işlevlerine yalıtım üzerine kaybetmek ve sınırlı bir kaynaktır. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) kullanımı pHH bir alternatiftir-tetkikine (iHeps)10türetilmiş. Özellikle iPSCs hastaya özgü olduğunu ve iHeps taze pHH önemli bir avantaj olan isteğe bağlı olarak üretilen bu yüzden sonsuza kadar yetiştirilir. Ayrıca, iPSCs da kolayca düzeltin veya daha sadık karşılaştırmalar11izin vermek için isogenic bir arka plan mutasyonların tanıtmak için tasarımcı enzimler ile genetik olarak.
İnsan karaciğer chimeric fare ile engrafted pHH insanlarda karaciğer metabolik profilleri, uyuşturucu yanıt ve hepatit virüsü enfeksiyonu12duyarlılık için benzerlikler gösterir. Bu hiperlipidemi vivo içindeçalışmak için iyi bir model sağlar. En çok kullanılan fare modelleri/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (FRG) fare13 ve uPA transgenik fare8içinde hangi ilâ %95 fare karaciğer pHH tarafından değiştirilebilir, temel alır. İlginçtir, bir rapora (FRG fare bağlı olarak) bir insan FH karaciğer chimeric fare ile pHH bir homozigoz LDLR mutasyon14taşıyan bir hastadan nitelendirdi. Bu modelde, repopulated insan tetkikine hiçbir işlev LDLR vardı ama artık fare tetkikine yaptım, böylece azaltmak belgili tanımlık yarar- in vivo LDLR yolu üzerinde güvenerek ilaçların test gerçekleştirmek için.
Burada, detaylı bir protokol FH iHeps Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) fare karaciğer engrafting için bizim kısa bir süre önce iş15 temel raporu. Bu insan karaciğer chimeric fare FH modelleme ve uyuşturucu testi gerçekleştirmek için yararlıdır içinde vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmalarda iHeps kemirgen kullanarak onlar devralınan karaciğer hastalıkları17eğitim için etkili bir yoldur doğruladı. Bu teknolojinin kullanımı daha da genişletmek ve geçerli FH hayvan modelleri suboptimal olduğu için biz LRG fareler FH iHeps engrafted ve engrafted LDLR +/-veya Heterozigoz LDLRgösterdi-mutasyona uğramış FH iHeps fareler plazma LDL-C düzeyini azaltabilir ve vivo içindeyanıt lipid düşürücü ilaçlar.
<p class="jov…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Shenzhen bilim ve teknoloji Konseyi temel araştırma programı (JCYJ20150331142757383), Çin Academy of Sciences (XDA16030502), Hong Kong araştırma hibe Konseyi Tema araştırma dayalı stratejik öncelik araştırma programı tarafından desteklenmiştir Düzeni (T12-705/11), Hong Kong özel idari bölge araştırma hibe Kurumu ve Çin (N-HKU730/12 ve 81261160506), araştırma takım projesinin Guangdong doğal bilim Ulusal Doğal Bilim Vakfı işbirliği programı Vakfı (2014A030312001), Guangzhou bilim ve teknoloji programı (201607010086) ve Guangdong Eyaleti bilim ve teknoloji programı (2016B030229007 ve 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
References
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
