Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ultraschall-gesteuerte Injektion von Neuroblastom (NB) und Ewing Sarkom (ES) Zellen zu nutzen (gegründet Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen) an biologisch relevanten Standorten erstellen zuverlässigere präklinische Modellen für Krebs Forschung.
Abstract
Präklinische Tests von Anti-Krebs-Therapien setzt auf relevante Xenograft-Modelle, die die angeborenen Tendenzen des Krebses zu imitieren. Vorteile des standard subkutane Flanke Modelle sind prozedurale Leichtigkeit und die Fähigkeit, Monitor Tumorprogression und Antwort ohne invasive Bildgebung. Solche Modelle sind oft widersprüchlich in translationalen klinischen Studien und eingeschränkten biologisch relevante Merkmale mit geringer Neigung, Metastasen, zu produzieren wie eine native Mikroumgebung fehlt. Im Vergleich dazu zeigten orthotopen Xenograft Modelle an native Tumor Standorten zu imitieren den Tumor Mikroumgebung und wichtige Erkrankung Merkmale wie Ferne Metastasierung zu replizieren. Diese Modelle erfordern oft mühsame Operationsverfahren mit Narkose längere Zeit und Erholung. Um dieses Problem anzugehen, haben Krebsforscher kürzlich Ultraschall-geführte Injektionstechniken zu Krebs Xenograft Modelle für präklinische Experimente, ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Einrichtung unter der Regie von Gewebe murinen Modellen genutzt. Ultraschall-Visualisierung ermöglicht auch eine nicht-invasive Methode zur longitudinalen Beurteilung der Tumor Engraftment und Wachstum. Hier beschreiben wir die Methode für die Ultraschall-gesteuerte Injektion von Krebszellen, unter Verwendung der Nebenniere für NB und renale Sub Kapsel für ES. Diese minimal-invasive Ansatz überwindet mühsam offene Operation Implantation von Krebszellen im Gewebe-spezifische Standorte für Wachstum und Metastasierung und morbide Erholungsphasen nachlässt. Wir beschreiben die Verwendung von etablierten Zelllinien und Patienten abgeleitete Zellinien zur orthotopen Injektion. Vorgefertigte kommerziellen Kits sind erhältlich für Tumor Dissoziation und Luciferase tagging von Zellen. Injektion von Zellsuspension mit Bildführung bietet eine minimalinvasive und reproduzierbare Plattform für die Erstellung von präklinischen Modellen. Diese Methode wird genutzt, um zuverlässige präklinischen Modellen für andere Krebsarten wie Blase, Leber und Bauchspeicheldrüse Veranschaulichung seiner ungenutzte Potenzial für zahlreiche Krebs-Modelle zu erstellen.
Introduction
Tierische Xenograft Modelle sind unverzichtbare Werkzeuge für präklinische Studien neuartiger Anti-Krebs-Therapien. Standard murinen Xenotransplantate setzen auf subkutane Flanke Implantation von Zellen, die vorsieht, dass einer effiziente und leicht zugänglichen Website Überwachung Tumorwachstum. Der Nachteil der subkutanen Modelle ist ihr Mangel an Tumor-spezifische biologische Merkmale, die ihr Potenzial metastasize1eingeschränkt werden kann. Solche Einschränkungen sind durch den Einsatz von orthotopen Xenotransplantate in welchem, die Tumor Zellen bei nativen Gewebe, die relevanten Mikroumgebung mit metastasierendem potenzielle2aufgeprägt sind. Orthotopen Xenograft Modelle erhalten ursprüngliche biologischen Eigenschaften und bieten zuverlässige Modelle für präklinische Drug Discovery3,4. Die Krebszellen genutzt für die Implantation unter der Regie von Gewebe sind etablierte Zelllinien oder Patienten gewonnenen Zellen von Patienten Tumoren. Gegründet von Krebszelllinien Xenotransplantate können hohe genetische Abweichung von den primären Tumor im Vergleich zu Patienten abgeleiteten Xenotransplantate5aufweisen. Angesichts dieser Tatsache ist die Einrichtung des Patienten abgeleitet orthotopen Xenotransplantate bevorzugter Standard für das Testen neuen Therapeutika in der Drogeentdeckung Krebs geworden.
In der pädiatrischen Krebs Neuroblastom (NB) orthotopen Xenograft Modelle rekapitulieren Primärtumor Biologie und Metastasen zu typischen Sehenswürdigkeiten der NB verteilt6,7zu entwickeln. NB entwickelt in der Nebenniere oder entlang der paravertebralen Grenzstrang. Die am häufigsten verwendeten Methoden der orthotopen Implantation erfordern offene Trans abdominale chirurgische Eingriffe. Solche Methoden sind oft langweilig, haben hohe Tier Morbidität und komplexe Erholungsphasen. Hochauflösende Ultraschall wurde vor kurzem für Gewebe gerichtet Implantation von Tumorzellen in der Entwicklung von mehreren murinen Modellen für Krebs Forschung8,9genutzt. Die Technik ist zuverlässige, reproduzierbare, effizient und sicher für die Einrichtung von entsprechenden metastasiertem Tumor Xenografts10,11.
Die Einrichtung der pädiatrischen Krebs Xenotransplantate durch Ultraschall-geführte Ziel Orgel Lokalisierung und Nadel Implantation von Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen ist nachgewiesene11. Die Technik war für NB gezielt an der murinen Nebenniere genutzt. Ewing Sarkom (ES) ist überwiegend ein knöcherner Krebs, häufig in den langen Röhrenknochen wie Femur und Beckenknochen12zu sehen. Fallberichte haben gezeigt, dass um festzustellen, ob eine überwiegend knöcherner Krebswachstum in renal Gewebe machbar ist, eine renale Sub Kapsel Lage für orthotopen Implantation13gewählt wurde. Renal Sub Kapsel Zelle Implantation von Tumorzellen ist als ein zukunftsträchtiges Modell, spontane Metastasen für ES14zu studieren verwendet worden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ultraschall-geführte Implantation von NB und ES Zellen ist eine effiziente und sichere Methode, um zuverlässige murinen Xenotransplantate für präklinische Studien in der Krebsbiologie zu etablieren. Entscheidend für den Erfolg des Ultraschall-geführte Gewebe gezielt Implantation ist die Präsenz und Verfügbarkeit von geschultem Personal mit Fachwissen in anatomisch Lokalisierung der Orgel von Interesse und Stereotaktische Injektion von Tumorzellen.
Die Dissoziation des Tumorgewebes erwi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Robert Wood Johnson Foundation/Amos medizinische Fakultät Entwicklung Programm, Taubman Research Institute, und die Sektion für Kinderchirurgie, der University of Michigan unterstützt. Die Autoren möchten Kimber Converso-Baran und Dr. Marcus Jarboe danken für die Unterstützung bei der Ultraschall-Injektionsverfahren und imaging Plattform. Wir danken Paul Trombley für seine Unterstützung bei der Abbildung Grafiken. Gewähren Sie wir danken auch die Abteilung für Radiologie an der University of Michigan für den Einsatz des Center für Molekulare Bildgebung und der Tumor-Imaging-Kern, die teilweise durch umfassende Cancer Center NIH unterstützt werden, P30 CA046592. Der University of Michigan Physiologie Phänotypisierung Kern, der teilweise durch Zuschüsse von der NIH (OD016502) und Frankel Cardiovascular Center unterstützt wird. Zelle Zeile Authentifizierung erfolgte bei IDEXX RADIEN Bioresearch Einrichtungen, Columbia, MO. Wir danken Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody und Mott solide Tumor-Onkologie-Programm. Unsere Patienten und Angehörigen sind dankbar für ihre Inspiration, Mut und kontinuierliche Unterstützung unserer Forschung anerkannt.
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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