अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऊतक के उपयोग-जैविक रूप से प्रासंगिक मेटास्टेटिक ट्यूमर की स्थापना के लिए सेलुलर आरोपण निर्देशित Xenografts
Summary
यहां, हम neuroblastoma के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (एनबी) और Ewing के सार्कोमा (ES) कोशिकाओं (स्थापित सेल लाइनों और रोगी-व्युत्पंन ट्यूमर कोशिकाओं) जैविक रूप से प्रासंगिक साइटों पर कैंसर के लिए विश्वसनीय नैदानिक मॉडल बनाने के लिए अनुसंधान.
Abstract
विरोधी उपचारों के नैदानिक परीक्षण प्रासंगिक xenograft मॉडल है कि कैंसर की जंमजात प्रवृत्तियों नकल पर निर्भर करता है । मानक चमड़े के नीचे पार्श्व मॉडल के लाभ प्रक्रियात्मक आसानी और आक्रामक इमेजिंग के बिना ट्यूमर प्रगति और प्रतिक्रिया की निगरानी करने की क्षमता शामिल हैं । इस तरह के मॉडल अक्सर शोधों नैदानिक परीक्षणों में असंगत हैं और मेटास्टेसिस का उत्पादन करने के लिए कम proclivity के साथ जैविक रूप से प्रासंगिक विशेषताओं को सीमित किया है, क्योंकि इसमें एक देशी microenvironment की कमी है । इसकी तुलना में, देशी ट्यूमर साइटों पर orthotopic xenograft मॉडल ट्यूमर microenvironment नकल और दूर मेटास्टेटिक प्रसार जैसे महत्वपूर्ण रोग विशेषताओं को दोहराने के लिए दिखाया गया है । इन मॉडलों अक्सर लंबी संवेदनाहारी समय और वसूली अवधि के साथ थकाऊ शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है । इस पते के लिए, कैंसर शोधकर्ताओं ने हाल ही में अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन तकनीक का उपयोग किया है के लिए नैदानिक प्रयोगों के लिए कैंसर xenograft मॉडल की स्थापना, जो ऊतक के तेजी से और विश्वसनीय स्थापना-निर्देशित murine मॉडल के लिए अनुमति देता है । अल्ट्रासाउंड दृश्य भी ट्यूमर engraftment और विकास के अनुदैर्ध्य आकलन के लिए एक इनवेसिव विधि प्रदान करता है । यहाँ, हम अल्ट्रासाउंड के लिए विधि का वर्णन-निर्देशित इंजेक्शन कैंसर कोशिकाओं के, नायब और ES के लिए गुर्दे उप कैप्सूल के लिए अधिवृक्क ग्रंथि का उपयोग. यह न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण विकास और मेटास्टेसिस के लिए ऊतक विशिष्ट स्थानों में कैंसर कोशिकाओं के थकाऊ खुला सर्जरी आरोपण पर काबू पाता है, और रुग्ण वसूली अवधि थमी । हम दोनों की स्थापना की सेल लाइनों और रोगी व्युत्पंन orthotopic इंजेक्शन के लिए सेल लाइनों के उपयोग का वर्णन । पूर्व निर्मित वाणिज्यिक किट ट्यूमर पृथक्करण और कोशिकाओं के luciferase टैगिंग के लिए उपलब्ध हैं । सेल निलंबन के इंजेक्शन छवि का उपयोग कर-मार्गदर्शन नैदानिक मॉडल के निर्माण के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव और reproducible मंच प्रदान करता है. इस विधि मूत्राशय, जिगर और अग्ंयाशय कई कैंसर मॉडल के लिए अपनी अप्रयुक्त क्षमता exemplifying जैसे अंय कैंसर के लिए विश्वसनीय नैदानिक मॉडल बनाने के लिए उपयोग किया जाता है ।
Introduction
पशु xenograft मॉडल उपंयास विरोधी चिकित्सा के लिए नैदानिक अध्ययन के लिए आवश्यक उपकरण हैं । मानक murine xenografts ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए एक कुशल और आसानी से सुलभ साइट प्रदान करने, कोशिकाओं के चमड़े के नीचे पार्श्व आरोपण पर भरोसा करते हैं । चमड़े के नीचे के मॉडल के नुकसान उनके ट्यूमर की कमी-विशिष्ट जीवविज्ञान विशेषताओं है, जो अपनी क्षमता को सीमित कर सकते है metastasize1। ऐसी सीमाएं orthotopic xenografts के उपयोग से दूर होती हैं, जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं देशी ऊतक साइटों पर engrafted हैं, मेटास्टेटिक संभावित2के साथ प्रासंगिक microenvironment प्रदान करते हैं । Orthotopic xenograft मॉडल मूल जैविक सुविधाओं को बनाए रखने और नैदानिक दवा डिस्कवरी3,4के लिए विश्वसनीय मॉडल प्रदान करते हैं । ऊतक-निर्देशित आरोपण के लिए उपयोग की जाने वाली कैंसर की कोशिकाओं या तो रोगी ट्यूमर से सेल लाइनों या रोगी व्युत्पंन कोशिकाओं की स्थापना कर रहे हैं । Xenografts कैंसर सेल लाइनों से स्थापित की प्राथमिक ट्यूमर से उच्च आनुवंशिक फर्क प्रदर्शन कर सकते है व्युत्पंन Xenografts5रोगी की तुलना में । इसे देखते हुए, रोगी की स्थापना-व्युत्पंन orthotopic xenografts कैंसर की दवा खोज में उपंयास चिकित्सीय परीक्षण के लिए पसंदीदा मानक बन गया है ।
बाल चिकित्सा कैंसर neuroblastoma (एनबी) में, orthotopic xenograft मॉडल दोहराऊंगा प्राथमिक ट्यूमर जीव विज्ञान और एनबी प्रसार के विशिष्ट साइटों के लिए मेटास्टेसिस विकसित6,7। एनबी अधिवृक्क ग्रंथि में या paravertebral सहानुभूति श्रृंखला के साथ विकसित करता है । orthotopic आरोपण के सबसे आम तरीकों खुले ट्रांस पेट शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । इस तरह के तरीकों अक्सर थकाऊ रहे हैं, उच्च पशु रुग्णता है, और जटिल वसूली अवधि । उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड कैंसर अनुसंधान8,9के लिए कई murine मॉडल के विकास में ट्यूमर कोशिकाओं के ऊतक-निर्देश आरोपण के लिए हाल ही में उपयोग किया गया है । तकनीक विश्वसनीय, reproducible, कुशल है, और प्रासंगिक मेटास्टेटिक ट्यूमर की स्थापना के लिए सुरक्षित है xenografts10,11।
अल्ट्रासाउंड के द्वारा बाल चिकित्सा कैंसर xenografts की स्थापना-निर्देशित लक्ष्य अंग स्थानीयकरण और सेल लाइनों और रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं के सुई आरोपण11का प्रदर्शन किया है. तकनीक एनबी murine अधिवृक्क ग्रंथि को लक्षित करने के लिए उपयोग किया गया था । है Ewing सार्कोमा (ES) मुख्य रूप से एक osseous कैंसर है, आमतौर पर ऐसी फीमर और श्रोणि हड्डियों के रूप में लंबी हड्डियों में देखा12। मामले की रिपोर्ट से पता चला है कि एक मुख्य रूप से osseous कैंसर के विकास कि क्या गुर्दे के ऊतकों, एक गुर्दे उप संपुटी स्थान में व्यवहार्य है निर्धारित करने के लिए orthotopic आरोपण13के लिए चुना गया था । गुर्दे उप संपुटी कोशिका आरोपण ट्यूमर कोशिकाओं का एक होनहार मॉडल ES14के लिए सहज मेटास्टेसिस अध्ययन के रूप में उपयोग किया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एनबी और ES कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड निर्देशित आरोपण कैंसर जीव विज्ञान में नैदानिक अध्ययन के लिए विश्वसनीय murine xenografts स्थापित करने के लिए एक कुशल और सुरक्षित तरीका है । अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऊतक की सफलता…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम रॉबर्ट वुड जॉनसन फाउंडेशन/अमोस चिकित्सा संकाय विकास कार्यक्रम, Taubman अनुसंधान संस्थान, और बाल चिकित्सा सर्जरी, मिशिगन विश्वविद्यालय के खंड से समर्थन प्राप्त किया । लेखक Kimber Converso-बारां और डॉ मार्कस Jarboe अल्ट्रासाउंड इंजेक्शन प्रक्रियाओं और इमेजिंग मंच के साथ सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम चित्र ग्राफिक्स के साथ उनकी सहायता के लिए पॉल Trombley धंयवाद । हम भी आणविक इमेजिंग और ट्यूमर इमेजिंग कोर, जो भाग में व्यापक कैंसर केंद्र NIH, अनुदान P30 CA046592 द्वारा समर्थित है के लिए केंद्र के उपयोग के लिए मिशिगन विश्वविद्यालय में रेडियोलॉजी विभाग का धंयवाद । मिशिगन फिजियोलॉजी Phenotyping कोर के विश्वविद्यालय है कि भाग में NIH (OD016502) और Frankel हृदय केंद्र से अनुदान के द्वारा समर्थित है । सेल लाइन प्रमाणीकरण IDEXX RADIL अनुसंधान सुविधाओं पर किया गया था, कोलंबिया, मो । हम छलनी Stoll, डॉ राजेन मॉडि और Mott ठोस ट्यूमर ऑन्कोलॉजी कार्यक्रम का धंयवाद । हमारे रोगियों और परिवारों को कृतज्ञता उनकी प्रेरणा, साहस, और हमारे अनुसंधान के चल रहे समर्थन के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
References
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