Her presenterer vi en protokoll for å bruke ultralyd-guidede injeksjon av neuroblastom (NB) og ewings sarkomspesialitet (ES) celler (etablert linjer og pasient-avledede kreftceller) på biologisk relevante nettsteder å lage pålitelige prekliniske modeller for kreft forskning.
Prekliniske testing av anticancer terapi er avhengig av relevante xenograft modeller som etterligner medfødt tendenser av kreft. Fordelene med standard subkutan flanke modeller inkluderer fremgangsmåter for letthet og skjermen svulst progresjon og uten invasiv bildebehandling. Slike modeller er ofte inkonsekvent i translasjonsforskning kliniske forsøk og har begrenset biologisk relevante egenskaper med lav proclivity å produsere metastasering, som det er en mangel på en innebygd microenvironment. Til sammenligning har orthotopic xenograft modeller på opprinnelige svulsten nettsteder vist å etterligne svulst microenvironment og gjenskape viktig sykdom egenskaper som fjerntliggende metastatisk spredning. Disse modellene krever ofte kjedelig kirurgiske prosedyrer med lengre bedøvende tid og utvinning perioder. Du løser problemet, har kreftforskere nylig benyttet ultralyd-guidede injeksjon teknikker for å etablere kreft xenograft modeller for prekliniske eksperimenter, som gir rask og pålitelig etablering av vev-rettet murine modeller. Ultralyd visualisering gir også en noninvasive metode for langsgående vurdering av svulst engraftment og vekst. Her beskriver vi metoden for ultralyd-guidede injeksjon av kreftceller, utnytte binyrene NB og nyre sub kapsel for ES. Denne minimal invasiv tilnærming overvinner kjedelig åpen kirurgi implantasjon av kreftceller i vevet-spesifikke steder for vekst og metastasering, og abates sykelig utvinning perioder. Vi beskriver bruken av både etablerte linjer og pasienten avledede cellelinjer for orthotopic injeksjon. Pre-laget kommersielle kits er tilgjengelig for svulst dissosiasjon og luciferase merking av celler. Injeksjon av cellen hjuloppheng med bilde-veiledning gir en minimalt invasiv og reproduserbar plattform for etablering av prekliniske modeller. Denne metoden benyttes for å opprette pålitelige prekliniske modeller for andre kreftformer som blæren, lever og bukspyttkjertel exemplifying sin uutnyttet potensial for mange kreft modeller.
Dyr xenograft modeller er viktige verktøy for prekliniske studier av romanen anticancer terapi. Standard murine xenografts er avhengige av subkutan flanke implantering av celler, gir en effektiv og lett tilgjengelig stedet for overvåking tumor vekst. Ulempen av subkutan modeller er deres mangel på svulst-spesifikke biologiske egenskaper, noe som kan begrense sitt potensial til metastase1. Slike begrensninger er overvunnet ved bruk av orthotopic xenografts i som tumor celler er engrafted på eget vev steder, gir en relevant microenvironment med metastatisk potensial2. Orthotopic xenograft modeller opprettholde opprinnelige biologiske egenskaper og gi pålitelig modeller for prekliniske drug discovery3,4. Kreftceller benyttes for vev-rettet implantasjon er etablert linjer eller pasient-avledede celler fra pasienten svulster. Xenografts opprettet fra kreftcelle linjer kan ha høy genetisk avvik fra den primære svulsten forhold til pasienten avledede xenografts5. Gitt dette, blitt etablering av pasient-avledede orthotopic xenografts foretrukket standard for testing romanen therapeutics i kreft stoffet funnet.
Pediatrisk kreft neuroblastom (NB), orthotopic xenograft modeller recapitulate primære svulst biologi og utvikle metastasering til typiske nettsteder NB spre6,7. NB utvikler i binyrene eller langs paravertebral sympatisk kjeden. De vanligste metodene for orthotopic implantasjon krever åpne trans-abdominale kirurgiske prosedyrer. Slike metoder er ofte kjedelig, har høy dyr sykelighet og komplekse utvinning perioder. Høyoppløselig ultralyd har nylig blitt utnyttet for vev-rettet implantasjon av kreftceller i utviklingen av flere murine modeller for kreft forskning8,9. Teknikken er pålitelig, reproduserbare, effektiv og sikker for etablering av aktuelle metastatisk svulst xenografts10,11.
Etableringen av pediatriske kreft xenografts ved ultralyd-guidede målet orgel lokalisering og nål implantering av linjer og pasient-avledede kreftceller er demonstrert11. Teknikken ble benyttet for NB rettet mot murine binyrene. Ewings sarkomspesialitet (ES) er hovedsakelig en osseous kreft, ofte sett i lange bein som femur og bekkenet bein12. Case rapporter har vist at for å avgjøre om veksten av en hovedsakelig osseous kreft er mulig i nyre vev, en nyre sub capsular plassering ble valgt for orthotopic implantasjon13. Nyre sub capsular celle implantasjon av kreftceller blitt benyttet som en lovende modell å studere spontan metastaser for ES14.
Ultralyd-guidede implantasjon av NB og ES celler er en effektiv og trygg metode å etablere pålitelig murine xenografts for prekliniske studier i kreft biologi. Avgjørende for suksessen til ultralyd-guidede vev målrettede implantasjon er tilstedeværelse og tilgjengeligheten av opplært personale med ekspertise i å lokalisere anatomisk orgelet rundt og i stereotactic injeksjon av kreftceller.
Av tumor vev viste seg for å være et viktig skritt i utviklingen av beskrevet pasient-avledede x…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet fikk støtte fra den Robert Wood Johnson Foundation/Amos medisinske fakultetet utvikling programmet, Taubman Research Institute, og del av Pediatric kirurgi, The University of Michigan. Forfatterne ønsker å takke Kimber periode-Baran og Dr. Marcus Jarboe for hjelp med ultralyd injeksjon prosedyrer og tenkelig plattformen. Vi takker Paul Trombley for hans hjelp med figur grafikk. Vi takker også avdeling for radiologi på The University of Michigan for bruk av The Center for molekylær Imaging og Tumor Imaging kjernen, støttes delvis av omfattende Cancer Center NIH, gi P30 CA046592. Universitetet i Michigan fysiologi Phenotyping kjerne som støttes delvis av gi finansiering fra NIH (OD016502) og Frankel Kretsløpssystem Center. Cellen linje godkjenning ble gjort på IDEXX RADIL Bioresearch fasiliteter, Columbia, har Mo Vi takker Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody og Mott Solid Tumor onkologi Program. Våre pasienter og familier er takknemlig anerkjent for inspirasjon, mot, og pågående støtte fra vår forskning.
Mice | |||
NOD-SCID | Charles River | 394 | |
NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
Cell Line | |||
NB | |||
IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
ES | |||
TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
Cell Line media | |||
RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
Dissociation | |||
Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
Cell Strainer | Corning | 431751 | |
Luciferase Tagging | |||
Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
Bioluminescence Imaging | |||
Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
D-Luciferin | Promega | E160X | |
Anesthetic | |||
Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
Ultrasound Guided Injection | |||
Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
Histology | |||
CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
Miscelleneous | |||
10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |