Utilisation des ultrasons guidés axés sur les tissus cellulaire Implantation pour la mise en place de xénogreffes tumorales métastatiques biologiquement pertinente

Summary

Nous présentons ici un protocole pour utiliser injection guidée par ultrason du neuroblastome (NB) et cellules (ES) le sarcome d’Ewing (établi de lignées cellulaires et les cellules tumorales dérivées de patient) aux sites biologiquement pertinentes pour créer des modèles précliniques fiables pour le cancer recherche.

Abstract

Des essais précliniques d’antinéoplasiques s’appuie sur des modèles de xénogreffes pertinentes qui imitent les tendances innées du cancer. Avantages des modèles standard de flanc sous-cutanée sont facilité procédurale et la capacité de surveiller la progression tumorale et la réponse sans imagerie invasives. Ces modèles sont souvent incompatibles dans les essais cliniques translationnelles et ont limité les caractéristiques biologiquement pertinentes avec faible propension à produire des métastases, comme il y a un manque d’un micro-environnement natif. En comparaison, des modèles de xénogreffes orthotopiques à native tumoraux ont démontré pour imiter le microenvironnement tumoral et de reproduire les caractéristiques de la maladie importante tels que les métastases lointain. Ces modèles nécessitent souvent fastidieuses procédures chirurgicales avec longues périodes de temps et récupération anesthésiques. Pour y remédier, chercheurs sur le cancer ont récemment utilisé des techniques d’injection guidée par échographie afin d’établir des modèles de xénogreffes de cancer pour les expériences précliniques, qui prévoit la mise en place rapide et fiable des modèles murins axés sur les tissus. Visualisation échographique fournit également une méthode non invasive d’évaluation longitudinale du greffe de la tumeur et de la croissance. Nous décrivons ici la méthode pour injection guidée par ultrason des cellules cancéreuses, utilisant la glande surrénale pour NB et de la capsule rénale sub pour ES. Cette approche mini-invasive surmonte l’implantation des cellules cancéreuses dans les localités de tissu-spécifique pour la croissance et la métastase fastidieux chirurgie ouverte et diminue les périodes de récupération morbide. Les auteurs décrivent l’utilisation de lignées cellulaires établies et lignées cellulaires dérivées patient pour injection orthotopique. Pré-faites kits commerciaux sont disponibles pour la dissociation de la tumeur et la luciférase marquage de cellules. Injection de la suspension de cellules à l’aide du guidage par l’image fournit une plate-forme minimalement invasive et reproductible pour la création de modèles précliniques. Cette méthode est utilisée pour créer des modèles précliniques fiables d’autres cancers tels que la vessie, foie et pancréas illustrant son potentiel inexploité de nombreux modèles de cancer.

Introduction

Des modèles de xénogreffes animales sont des outils indispensables pour les études précliniques de nouveaux traitements anticancéreux. Xénogreffes murines standards s’appuient sur l’implantation sous-cutanée flanc des cellules, offrant un site efficace et facilement accessible pour la surveillance de la croissance tumorale. L’inconvénient des modèles sous-cutanée est leur manque de caractéristiques biologiques propres à la tumeur, qui peut limiter leur capacité à métastaser¹. Ces limites sont dépassées par l’utilisation des xénogreffes orthotopiques dans les tumeurs des cellules sont implantés sur les sites de tissus natifs, fournissant un micro-environnement pertinent avec potentiel métastatique². Des modèles de xénogreffes orthotopiques maintiennent les éléments d’origine biologiques et fournissent des modèles fiables pour médicament préclinique découverte^3,4. Les cellules cancéreuses utilisées pour l’implantation de tissus dirigée sont lignées cellulaires établies ou des cellules dérivées de patient patients tumeurs. Xénogreffes, établis à partir de lignées cellulaires cancéreuses peuvent présenter un forte divergence génétique de la tumeur primaire par rapport aux patients des xénogreffes dérivés⁵. Ceci étant dit, la mise en place des xénogreffes orthotopiques dérivé de patient est devenu la norme préférée pour l’essai de nouvelles thérapeutiques dans la découverte de médicaments du cancer.

Dans le neuroblastome cancer pédiatrique (NB), des modèles de xénogreffes orthotopiques récapitulent la biologie de la tumeur primitive et de développent des métastases aux sites typiques de NB répartis^6,7. NB se développe dans la glande surrénale ou le long de la chaîne sympathique paravertébraux. Les méthodes les plus courantes d’implantation orthotopique nécessitent des procédures chirurgicales transabdominale ouvertes. Ces méthodes sont souvent fastidieux, ont une morbidité élevée animale et les périodes de récupération complexe. Échographie haute résolution a été récemment utilisé pour axés sur les tissus implantation de cellules tumorales dans le développement de plusieurs modèles murins pour cancer recherche^8,9. La technique est fiable, reproductible, efficace et sans danger pour la mise en place de tumeur métastatique des xénogreffes^10,11.

La mise en place de xénogreffe de cancer pédiatrique par l’implantation de localisation et de l’aiguille d’orgue cible guidée par échographie de lignées cellulaires et les cellules tumorales dérivées de patient est démontrée¹¹. La technique a été utilisée pour NB ciblé à la glande surrénale murine. Sarcome d’Ewing (ES) est principalement un cancer osseux, couramment observé dans les os longs comme le fémur et de la ceinture pelvienne de¹². Rapports de cas ont montré que, pour déterminer si la croissance d’un cancer en principalement osseux est faisable dans le tissu rénal, un emplacement capsulaire void rénale a été choisi pour orthotopique implantation¹³. Implantation de cellule capsulaire void rénale des cellules tumorales a été utilisée comme un modèle prometteur pour l’étude des métastases spontanées pour ES¹⁴.

Protocol

Tout le travail a été fait conformément à The University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) et est conforme aux procédures approuvées par le Comité de l’Université sur l’utilisation et l’entretien des animaux (UCUCA). L’unité pour le laboratoire de médecine animale (ULAM) a supervisé les soins aux animaux.

Tout le travail a été fait avec l’approbation de l’Université du Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) et est conforme à toutes les recherches humaines éthique Comité réglementation. Les cellules humaines sont considérés comme une matière potentiellement, afin de suivre toutes les précautions spéciales et des pratiques de biosécurité appropriées qui sont requis par votre établissement. NSG souris sont sévèrement immunodéprimés et sensibles aux maladies causées par des bactéries communément trouvés dans l’environnement.
Utilisez toujours strictement technique stérile lors de la préparation des matériaux pour l’implantation et effectuer les injections.

1. Culture cellulaire

1. Croissance établies lignées de cellules humaines pour NB (SH-SY5Y, SK-N-BE2 et IMR32) dans un milieu minimum essentiel, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 2 mM de glutamine, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Supplément IMR32 cellules de plus avec 1 mM pyruvate et 0,075 % NaHCO₃. Maintenir toutes les cellules à 37 ° C, 5 % de CO₂ et confluence de 70-80 %_.
2. Cultiver des lignées de cellules ES humaines (TC32, A673, ABSC-25 et A4573) dans un milieu RPMI additionné de sérum de veau fœtal 10 % et de 6 mM de L-glutamine. Maintenir toutes les cellules à 37 ° C, 5 % de CO₂ à 70-80 % confluence_.
3. Envoyer toutes les lignées cellulaires pour l’authentification.
   Remarque : La cellule authentification est effectuée dans une installation extérieure, veuillez vous référer aux remerciements.

2. préparation des cellules de la tumeur primaire dérivé de Patient

1. Avec le consentement du patient et la sanction, récolter des tissus humains mis au rebut de tumeur NB de patients devant subir une résection chirurgicale pour un contrôle local et le transport au laboratoire de la solution de stockage de tissus pour la conservation.
   Remarque : Tous les échantillons de patients sont rendus anonymes et traitées conformément aux directives de l’Institutional Review Board.
2. Générer une suspension de cellules seul cancer patient dérivés (UMNBL001, UMNBL002) à partir de tissu de tumeur à l’aide d’un kit de dissociation de tumeur. Transférer environ 0,5 g de tumeur dans une boîte de Petri de cellule 100 mm contenant 5 mL de tampon RPMI, 200 µL d’enzyme H, 100 µL d’enzyme R et 25 µL d’enzyme A partir du kit de dissociation tumorales humaines.
3. Émincer la tumeur en petits morceaux (2 à 4 mm) à l’aide de ciseaux et pinces à tissus. Mélanger ces fragments avec les solutions à l’étape 2.2.
4. Dans un tube dissociator, déposer le mélange de la tumeur et fermer le tube. Inverser le tube et fixez sur le manchon de la dissociator tissulaire. Exécutez le programme h_tumor_01.
5. Incuber la suspension de cellules de tumeur obtenue ci-dessus à 37 ° C pendant 1 h sur un comptoir tournant avec intermittente trituration toutes les 15 min.
6. La suspension de cellules de transfert dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajouter 10 mL de milieu RPMI. Centrifuger la suspension cellulaire à 314 x g pendant 5 min.
7. Retirez le surnageant et suspendre le culot dans 5 mL de RPMI. Passez cette solution à travers un tamis de cellule de 40 µm et recueillir la solution tendue dans un tube conique frais 50 mL. Lavez cette passoire une fois avec 5 mL de médias RPMI et centrifuger le mélange à 314 x g pendant 5 min recueillir une boulette.
8. Mesurer la densité des cellules à l’aide d’un Hémacytomètre¹⁵. Suspendre le culot obtenu par le haut dans RPMI pour obtenir une concentration finale de 4 × 10⁵ cellules/10 µL. Prendre 5 µL de cette suspension cellulaire et 5 µL de matrigel à faire 10 µL de solution portable pour chaque injection.
   NOTE : Montant de RPMI utilisé dépend de la mesure de la densité cellulaire. Par exemple, si la densité des cellules mesurée du culot obtenu est 4 x 10⁵ cellules, suspendre le culot dans 10 µL de RPMI.

3. luciférase marquage des cellules cancéreuses

1. Faire 10 mL de médias de transduction avec 5 mL du surnageant viral EF1a-Luc2-IRES-mCherry et 5 mL de cellules souches médias. Ajouter 7,5 µL de polybrene 1 x.
2. Mélanger 5 × 10⁶ cellules de cancer dans les médias de transduction et plaque en plaque de fixation ultra faible de 100 mm. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   Remarque : Comme les plaques de fixation bas sont utilisés, cellules n’adhérera pas à la plaque.
3. Après 24h, ramenez la plaque de 100 mm contenant des cellules sous capot de culture de tissus et transférer le mélange dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire à 314 x g pendant 5 min obtenir le culot cellulaire. Laver le culot cellulaire une fois avec 1 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et suspendre le culot dans 1 mL de HBSS contenant 1 % sérum fœtal (SVF).
   1. Trier les cellules luciférase fondées sur le signal positif GFP sur cellule activée par fluorescence tri analyse (FACS). Plaque les cellules triées sur culture de tissus de 100 mm traité plat et maintiennent au confluent de 70 à 80 %, 37 ° C et 5 % CO₂ jusqu'à leur utilisation.
4. Confirmer la luciférase signal avec trousse luciférase. Plaque de 10 x 10⁴ tri cellules / puits dans un illuminometer compatible 96 bien plat et incuber les cellules durant la nuit à 37 ° C et 5 % de CO₂. Après 24h, porter la plaque 96 puits à température ambiante et ajouter Steady-Glo réactif aux médias cultivés dans les puits en rapport 1:1. Permettre aux cellules de lyser pendant 5 min et lire de luminescence dans le spectrophotomètre.
5. Apportez le plat de 100 mm sous une hotte de culture de tissus. Jeter les surnageants médias. Laver les cellules une fois avec 2 mL de PBS 1 x.
6. Ajouter 2 mL de 0,25 % de trypsine et remettez le plat de 100 mm dans l’incubateur pendant 2-3 min. Après 2-3 min, vérifier les cellules délogent sous microscope et ajoutez 8 mL de RPMI pour désactiver la trypsine.
7. Recueillir la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 314 x g pendant 5 min obtenir une boulette. Jeter le surnageant. Laver le culot cellulaire avec 1 mL de PBS 1 x, suspendre le culot dans 5 mL de RPMI et déterminer la densité des cellules à l’aide d’un Hémacytomètre¹⁵. Centrifuger yhe restant solution cellulaire à 314 g pendant 5 min obtenir une boulette.
8. Suspendre le culot dans RPMI pour obtenir une concentration de 4 x 10⁵ cellules/10 µL. Prendre 5 µL de la suspension cellulaire et 5 µL de matrigel à faire 10 µL de solution portable pour chaque injection.

4. ultrasons guidés glande surrénale (NB) ou l’Implantation de Capsule (ES) Sub rénale

Remarque : Toutes les procédures d’inspection par ultrasons sont effectuées en utilisant une haute résolution en vivo système d’imagerie. Les procédures décrites, le transducteur, qui a une fréquence de 40 MHz et une bande passante de 22 à 55 MHz ont été utilisé.

1. Utiliser 6-8-week-old immunodéficientes NSG souris de toutes les méthodes d’injection.
2. Refroidir le matrigel et autoclavés seringues Hamilton munis d’une aiguille de 27G (1.25"), et les cathéters de 22G (0,9 mm de diamètre extérieur, longueur 25 mm) pour la nuit à 4 ° C.
3. Placer la solution cellulaire établie à l’étape 3 sur la glace.
4. Anesthésier les souris dans une chambre d’induction à l’aide de 2 % isoflurane O₂ livré à 2 L/min.
   Remarque : Anesthésie adéquate est déterminé avec le manque de mouvement actif et le maintien de la respiration spontanée.
5. Une fois anesthésié, épiler le dos et les flancs des animaux à l’aide de la lotion de suppression de cheveux (comme Nair) et un rasoir.
6. Transférer l’animal à la plate-forme d’imagerie abdominale, face vers le bas, où le nez de l’animal est placé dans une ogive et sécurisé tout en inspirant l’isoflurane.
7. Placez optique pommade dans les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement. Tape la souris en place pour empêcher tout mouvement involontaire.
8. Identifier le foie murine, vena cava, rate, rein gauche et glande surrénale gauche adjacente à l’aide de visualisation échographique.
9. Utiliser des gants stériles, masque et capuchon de protection personnelle et d’entretien des conditions stériles. Sous guidage échographique, délicatement insérer un cathéter de 22G à travers la peau et muscle de retour directement dans la glande surrénale gauche de fournir un canal pour injection cellulaire. Retirer l’aiguille et laisser le cathéter en place.
10. Charge une seringue de Hamilton réfrigérée munie d’une aiguille de petit calibre avec 10 µL de solution de la cellule, puis guider la seringue stereotactically par le cathéter placé dans le centre de la glande surrénale.
11. Injecter les cellules dans le tissu surrénalien ciblé. Laisser l’aiguille en place pendant 1-2 min permettre le matrigel à définir. Retirez lentement l’aiguille, suivi par le retrait du cathéter.
12. Replacez les souris dans leur cage, puis assurez-vous que la souris reprend conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
    NOTE : en raison de la nature invasive de cette technique, douleur post est minime, mais toujours surveillé sur une base quotidienne avec des contrôles de santé souris. » devrait être suivi par une phrase : « si inattendu des signes de douleur ou de détresse sont identifiées au cours d’une expérience, consulter votre unité de soutien institutionnel de vétérinaire pour plus d’informations au sujet de l’analgésie ou d’autres soins médicaux.
    

Results

En utilisant les procédures présentées, guidée par échographie d’implantation de cellules NB dans la glande surrénale a été faite dans une salle dédié équipée d’une table d’opération chirurgicale chauffée. Plaquettes de bras et les pieds ont été placées pour surveiller l’activité de coeur murines (Figure 1 a). L’animal est resté anesthésié sous isoflurane utiliser coiffe l’inhalation. À l’aide d’une sonde d’échographie...

Discussion

L’implantation des cellules NB et ES guidée par échographie est une méthode efficace et sûre pour établir des xénogreffes murines fiables pour les études précliniques en biologie du cancer. Essentielle à la réussite de guidée par échographie ciblée tissus implantation est la présence et la disponibilité de personnel qualifié ayant une expertise dans la localisation anatomique de l’organe d’intérêt et stéréotaxique injection des cellules tumorales.

La dissociation du t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
souris
NOD-SCID	Charles River	394
NSG	The Jackson Laboratory	5557
Cell Line  ;
NB
IMR-32	ATCC	CCL-127	Lignée cellulaire de neuroblastome humain établie
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Lignée cellulaire de neuroblastome humain établie
SK-N-Be2	ATCC	CRL-2271	Lignée cellulaire de neuroblastome humain établie
< forte>ES
TC32  ;			Lignée cellulaire de sarcome d’Ewing humain
établie A673	COGcell.ORG		Lignée cellulaire de sarcome d’Ewing humaine
CHLA-25	COGcell.ORG		Lignée cellulaire de sarcome d’Ewing humain établie
A4573	COGcell.ORG		Lignée cellulaire de sarcome d’Ewing humaine établie
Cell Line media
RPMI	Life Technologies	11875-093
Matrigel	BD BioSciences	354234
Dissociation
Dissection Tools	KentScientific	INSMOUSEKIT
Human Tumor DissociationKit  ;	MACS Miltenyi Biotec	130-095-929
gentleDissociateur MACS	Miltenyi Biotec	130-093-235
gentleTubes MACS	Miltenyi Biotec	130-096-334
Filtre cellulaire	Corning	431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 virus	University du Michigan, Vector Core		Luciferase
Virus Steady Glo-Luciferase Assay Kit	Promega	E2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging System	PerkinElmer	124262
D-Luciferin	Promega	E160X
Anesthetic
Isoflurane inhalé  ;	Piramal Critical Care Inc	66794-0017-25
Injection guidée par ultrasons
Vevo 2100 Imagerie haute résolution	Vevo	2100
Seringues Hamilton (aiguille de calibre 27)	Hamilton	80000
Angiocathéter de calibre 22	BD Biosciences	381423
Pommade optique	Principaux produits pharmaceutiques	301909
Nair	Church & Dwight Co		Agent d’épilation
Aquasonic 100 Gel de transmission d’ultrasons	Gel d’échographie	Parker
histologie
CD99	DAKO	M3601	Anticorps primaire
Tyrosine Hydroxylase	Sigma-Aldrich	T2928
Anticorps primaire Anticorps secondaire HRP-Polymer	Pipettes Biocare	BRR4056KG
Miscelleneous
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10J
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10H
1,5 mL Microtubes à centrifuger	Fisher Scientific	05-408-129
Pipette P1000	Eppendorf
Pipette P200	Eppendorf	3120000054
P1000 pointes de pipette	Fisher Scientific	21-375E
P200 pointes de pipette	Fisher Scientific	21-375D
Aide à la pipette portable	Drummond	4-000-101
balance numérique pour animaux  ;	KentScientific	SCL-1015
Etriers	Fisher Scientific	06-664-16
Plaques de fixation basses 6 puits	Corning	07-200-601
10 cm Boîtes traitées pour culture tissulaire	Fisher Scientific	FB012924
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G