Аденоассоциированный вирус опосредованной доставку ТРИФОСФАТЫ сердечной гена, редактирования в мышей
Summary
Здесь мы предоставляем подробный протокол для проведения в естественных условиях сердечной гена редактирования мышей с использованием рекомбинантного вируса Adeno-Associated (rAAV)-опосредованной доставки ТРИФОСФАТЫ. Этот протокол предлагает многообещающие терапевтические стратегии для лечения дистрофических кардиомиопатия в мышечной дистрофии Дюшенна и может использоваться для создания сердца конкретных нокаут в послеродовой мышей.
Abstract
Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие, рецидивирующий повторить (ТРИФОСФАТЫ) системы в значительной степени способствовало генома в культивируемых клеток и организмов из различных видов техники. ТРИФОСФАТЫ технология была также изучена как Роман терапии для целого ряда заболеваний человека. Доказательства в концепция данные являются весьма обнадеживающими, как свидетельствуют последние исследования, демонстрирующие осуществимость и эффективность генов на основе редактирования терапевтический подход для мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) с помощью мышиных модели. В частности внутривенные и внутрибрюшинного введения rh.74 серотип рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) (rAAVrh.74) позволила сердца эффективности стафилококк ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (SaCas9) и два Руководство РНК (gRNA) для удаления геномной региона с мутант кодон в экзона 23 гена Dmd мыши. Этот же подход может также использоваться для Нокаут гена интереса и изучить их функции сердца в послеродовой мышей, когда gRNA предназначен для кодирования региона гена. В этом протоколе мы подробно показать, как инженер-rAAVrh.74 ТРИФОСФАТЫ вектор и как добиться высокоэффективных сердца доставки в новорожденных мышей.
Introduction
Кластеризованный, регулярно interspaced, короткие палиндром повторить (ТРИФОСФАТЫ) технология представляет самые последние улучшения в геном инженерии и изменил существующую практику генетики в клетки и организмы. Основанный ТРИФОСФАТЫ генома редактирования использует один руководство РНК (gRNA) направить связанные ТРИФОСФАТЫ эндонуклеазы например ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) и Cpf1 геномной ДНК цель, которая дополняет в последовательности protospacer кодируемых gRNA с конкретных protospacer прилегающие мотив (PAM)1,2. Диспетчер PAM варьируется в зависимости от бактериальных вида Cas9 или Cpf1 гена. Наиболее часто используемым Cas9 Нуклеаза, производный от Streptococcus pyogenes (SpCas9) признает PAM последовательность NGG, найденной в геномной ДНК, на стренги непромысловых прямо вниз по течению от последовательности целевого объекта. На конечном сайте Cas9 и Cpf1 белки генерировать двухручьевой перерыв (DSB), который затем отремонтировать через встроенные клеточных ДНК ремонт механизмов, включая не гомологичных конец присоединения (NHEJ) и ориентированные на гомологии ремонт (HDR) пути3, 4. В отсутствие шаблона для гомологичная рекомбинация ДНК DSB главным образом отремонтированы по ошибкам NHEJ пути, что может привести к вставки или удаления (indels) нуклеотидов, вызывая мутации фреймшифт если ОУС были созданы в кодирование региона гена5,6. Таким образом система ТРИФОСФАТЫ широко использовался для инженер функция потерь мутации в различных клеточных моделях и весь организмов, для того, чтобы исследовать функции гена. Кроме того каталитически неактивных Cas9 и Cpf1 были разработаны для транскрипционно и эпигеномно модулировать выражение целевых генов7,8.
Совсем недавно, SpCas9 и SaCas9 (производное от золотистого стафилококка) были упакованы в векторы рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) для коррекции послеродовой гена в животной модели заболеваний человека, в частности, Дюшенна мышечная дистрофия (ДМД)9,10,11,12,13,14,15. ДМД это роковой Х-хромосомой рецессивных заболеваний вызванных мутациями в гене DMD , который кодирует белок делеций16,17, затрагивающих примерно один в 3500 мужчин рождений по данным обследования новорожденных18 , 19. Он характеризуется прогрессивная мышечная слабость и тратить. ДМД пациентов обычно теряют способность ходить между 10 и 12 лет и умирают дыхательной или сердечной недостаточности в возрасте 20-30 лет20. В частности, развивается кардиомиопатия > 90% пациентов DMD и является ведущей причиной смерти в ДМД пациентов21,22. Хотя Deflazacort (противовоспалительным наркотиков) и Eteplirsen (экзона, пропуская медицины для пропуска экзона 51) недавно были одобрены для ДМД продовольствия и медикаментов (FDA)23,24, ни один из этих методов лечения Исправьте генетический дефект на уровне геномной ДНК. Mdx мышь, которая носит Точечная мутация в экзона 23 делеций гена, широко используется как модель DMD25. Кроме того ранее мы показали, что функциональные делеций выражение был восстановлен в кадр удаления геномной ДНК, охватывающих экзонов, 21, 22 и 23 в скелетных мышцах мышей многомерных выражений с помощью внутримышечной Ad-SpCas9/gRNA доставки9 и в сердечной мышцы mdx/utrophin+ / мышей с помощью внутривенного и внутрибрюшной rAAVrh.74-SaCas9/gRNA доставки26.
В этом протоколе мы подробно каждый шаг в послеродовой сердечной гена редактирования для восстановления делеций в многомерных выражений/utrophin+ / мышей с использованием rAAVrh.74-SaCas9/gRNA векторов, от проектирования gRNA делеций анализа в разделах мышцы сердца.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы подробно все шаги, необходимые для достижения в естественных условиях сердечной гена редактирования в послеродовой мышей с помощью rAAVrh.74 опосредованной доставки SaCas9 и два оформления. Как отмечалось ранее, этот подход может использоваться для восстановления де…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
О.в. поддерживается США национальные институты здравоохранения грантов (R01HL116546 и R01 AR064241).
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
