Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의
Summary
여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복 (CRISPR) 시스템은 크게 배양된 세포에 다양 한 종의 생물 게놈 엔지니어링을 촉진 했다. CRISPR 기술 또한 인간의 질병의 숫자에 대 한 새로운 치료제로 탐험 되었습니다. 개념 증명 데이터는 매우 고무적인 타당성과 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) murine 모델을 사용 하 여에 대 한 편집 기반 치료 방법은 유전자의 효능을 설명 하는 최근 학문에 의해 exemplified입니다. 특히, 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74)의 정 맥 및 복 주사 (SaCas9) 포도 상 구 균 CRISPR 관련 단백질 9의 효율적인 심장 배달 및 2 있었습니다. exon 23 마우스 Dmd 유전자에에서 돌연변이 codon 게놈 영역을 삭제 하려면 RNAs (gRNA) 안내. 이 같은 방법은 유전자의 관심 밖으로 노크 하는 gRNA 유전자의 코딩 지구를 대상으로 설계는 출생 후 마우스에 그들의 심장 기능을 공부도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 표시 rAAVrh.74 CRISPR 벡터 하는 방법 및 신생아 쥐에 고효율 심장 납품을 달성 하는 방법.
Introduction
클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술 게놈 엔지니어링에서 가장 최근의 발전을 나타내고 세포와 유기 체 유전학의 현재 연습을 혁명을. CRISPR 관련 된 단백질 (Cas9) 9 등 CRISPR 관련 endonuclease 직접 단일 가이드 RNA (gRNA)을 이용 한다 CRISPR 기반 게놈 편집 하 고는 protospacer 시퀀스에 보완은 genomic DNA 대상에 Cpf1와 gRNA에 의해 인코딩 한 특정 protospacer 인접 한 모티브 (PAM)1,2. PAM은 Cas9 또는 Cpf1 유전자의 세균성 종에 따라 다릅니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 파생 된 가장 일반적으로 사용 되 Cas9 nuclease NGG 비 대상 가닥에 genomic DNA에서 직접 대상 시퀀스의 다운스트림 발견 되는 팸 시퀀스를 인식 합니다. 대상 사이트에 Cas9 및 Cpf1 단백질 생성 등 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 상 동 감독 수리 (HDR) 경로3내장 세포 DNA 수리 메커니즘을 통해 복구 다음, 이중 가닥 휴식 (DSB) 4. 동종 재결합에 대 한 DNA 템플렛의 부재, DSB는 주로 수리 삽입 또는 삭제 (indels)에서 발생할 수 있는 오류가 NHEJ 통로 DSB 코딩에서 만들어진 경우 frameshift 돌연변이 일으키는 뉴클레오티드의 6유전자5,지역. 따라서, CRISPR 시스템은 널리 사용 되었습니다 다양 한 휴대폰 모델 및 전체 유기 체에 있는 손실의 기능 돌연변이 하는 유전자의 기능을 조사 하기 위하여. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 및 Cpf1 transcriptionally를 개발 되었습니다 그리고 epigenetically 조절 대상 유전자7,8의 표현.
더 최근에, SpCas9 및 SaCas9 ( 황색 포도상구균에서 파생 됨)는 패키지 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 벡터 인간 질환의 동물 모델에서 출생 후 유전자 교정용으로 특히, 듀 켄 씨 근 위축 증 (DMD)9,10,11,12,13,,1415. DMD는 치명적인 X 연결 된 열성 질병 dystrophin 단백질16,17인코딩하는 DMD 유전자에 있는 돌연변이 기인한 신생아 심사18 에 따르면 약 3500에서 한 남성 출생에 영향을 미치는 , 19. 진보적인 근육 약점 그리고 낭비 특징 이다. DMD 환자는 일반적으로 20-30 년20의 나이 10 ~ 12 세 사이의 호흡기 또는 심장 실패의 다이 걸을 기능 손실. 특히, 심근에 개발 > DMD 환자와 나타냅니다 DMD 환자21,22에 죽음의 주요 원인의 90%. 비록 Deflazacort (항 염증 약물) 및 Eteplirsen (는 엑손 exon 51를 건너뛰는 데 약을 건너뛰는) 최근 승인 된 DMD에 대 한 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)23,24, 이러한 치료의 게놈 DNA 수준에서 유전적 결함을 수정 합니다. Exon 23 dystrophin 유전자의 점 돌연변이 운반, mdx 마우스 DMD 모델25로 널리 사용 되었습니다. 또한, 우리 이전 기능 dystrophin 식 취재 exons 21, 22, 23 일 근육 광고-SpCas9/gRNA 배달9 사용 하 여 mdx 쥐의 골격 근육에서 게놈 DNA의 프레임 삭제에 의해 복원 된 시연 , 그리고 정 맥 및 복 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 배달26를 사용 하 여 mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 근육에.
이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 출생 후 심장 유전자 dystrophin mdx/utrophin/- 생쥐 dystrophin 분석 심장 근육 섹션에 gRNA 디자인에서 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 벡터를 사용 하 여 복원 하려면 편집 모든 단계.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 우리 vivo 심장 유전자 SaCas9 및 2 개의 gRNAs의 납품 rAAVrh.74 중재를 사용 하 여 출생 후 생쥐에서 편집을 달성 하는 데 필요한 모든 단계를 상세하게. 이전 지적,이 이렇게 dystrophic 쥐에서 dystrophin 식27의 우리의 작업 설명 된 대로 복원 사용할 수 있지만 그것은 또한 급속 한 반전 유전학 연구의 긴 과정 없이 쥐 심장 관련 유전자의 활성화 수는 생성 하 고 사육…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
상대습도 미국 (R01HL116546 및 R01 AR064241) 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
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