Summary

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Published: May 04, 2018
doi:

Summary

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

Abstract

Trans 플라스마 막 전자 전송 (tPMET) extracellular oxidants에 의해 세포내 감소 스트레스 로부터 세포의 보호 뿐만 아니라 손상 으로부터 보호 역할을 하고있다. Extracellular oxidants 세포내 reductants에서 전자 수송의이 과정은 잘 정의 된. 여기 우리 C2C12 myotubes tPMET 세포 외 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 여 spectrophotometric 분석 실험을 제시: 수용 성 tetrazolium 소금-1 (서 부 표준시-1)과 2, 6-dichlorophenolindophenol DPIP (DCIP). 이러한 전자 수락자의 감소, 통해 우리는 실시간 분석에이 과정을 모니터 할 수 있습니다. 효소 superoxide dismutase (SOD)는 분석 실험을 하는데 산화 효소 (AO) 등의 추가 함께 우리 tPMET의 부분 각각 하는데 수출 또는 초과 생산 때문입니다 확인할 수 있습니다. 서 부 표준시-1 낮은 배경 가진 안정적인 결과를 표시 했다, 그러나 DPIP AO와 spectrophotometric 분석 시연 했다 잔디의 추가 후 다시 산화 될 수 있었다. 이 메서드는 실시간, 빠른 멀티 잘 spectrophotometric 분석 결과 tPMET, ferricyanide (FeCN) ferricytochrome c 감소 등을 모니터링 하는 데 사용 하는 다른 방법을 통해 장점 보여 줍니다.

Introduction

전자 수락자를 줄이기 위해 순화 된 플라즈마 막 수 플라즈마 멤브레인 고유의 redox 용량1는 보기를 주도하 고 있다. 이전에 곰 팡이, 식물, 그리고 동물에서 본, tPMET는 여러 생물2,3,,45에 공통 프로세스입니다. 특히,이 과정은 Saccharomyces cerevisiae, 당근 세포, 적혈구, 림프 톨, 다리, 흑색 종, 대 식 세포, 골격 근육, 및 호 중구2,3, 에서 입증 되었습니다. 4 , 5 , 6 , 7. extracellular oxidants를 줄이기 위해 플라즈마 막에 걸쳐 전자를 수송 하는 과정에서 tPMET는 포함 하는 많은 세포 기능에 관여: 세포 성장5,8, 세포 생존 능력9, 철 대사10,11,,1213, 반응성 산소 종12,,1415보호를 신호 하는 세포입니다. 많은 세포질 기능에 tPMET의 개입으로 인해 tPMET의 불균형은 암16,17, 심혈 관 질환 포함 한 몇 가지 심각한 건강 상태의 발전에 기여할 가설 되었습니다 및 대사 증후군18.

원형질 막의 전자 전송을 모니터링 하는 여러 가지 하지만 가장 널리 사용 되는 기술 색도계 분석 실험을 통해 세포 외 전자 수락자의 감소를 평가 하는 것입니다. 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자 tetrazolium 소금, DPIP, FeCN, 그리고 ferricytochrome c19,20있습니다. 가장 일반적으로 사용 되는 tetrazolium 소금은 2 세대 소금 알려진 서 부 표준시-119. 이 화합물은 1 세대 tetrazolium 소금 두 된 그룹,21의 물 가용성 증가 하는 때문에 비해 색도계 분석 실험에 활용 하기가 쉽습니다. 중간 전자 수락자 1-methoxy-phenazine methosulfate (Mpm)와 함께에서 서 부 표준시-1, 2 단 전자 전송 이벤트에서 감소 된다. 이 감소는 더 강렬한, 노란색 formazan20,22에 약하게 색 산화 형태의 서 부 표준시-1을 변경합니다. 서 부 표준시-1 높은 분석 결과 감도21,22로 이어지는 37 x 103 M-1c m-1의 높은 어 금 니 소 광 계수가 있다. DPIP는 또한 tPMET를 모니터링 하는 extracellular 전자 수락자로 이용 된다. 그것은 그 DPIP 감소 될 수 있다 extracellularly 중간 전자 수락자23,24의 도움 없이 tPMET에 의해 표시 되었습니다. 중간 전자 수락자의 부족, DPIP 픽업 전자를 서 부 표준시-124달리 플라즈마 막에서 직접 수 있습니다. DPIP와 마찬가지로 FeCN 줄어들 extracellularly ferrocyanide 중간 전자 수락자19,24의 도움 없이 tPMET에 의해에 표시 되었습니다. 서 부 표준시-1, DPIP와 달리 FeCN 낮은 분석 결과 감도9로 이어지는 낮은 어 금 니 소멸 계수가 있다. TPMET 모니터를 또 다른 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자는 ferricytochrome c. 서 부 표준시-1, ferricytochrome c 감소 증가 중간 전자 수락자, Mpm22의 사용과 비슷합니다. 서 부 표준시-1과는 달리, ferricytochrome c 방법은 높은 배경 및 낮은 분자량 소멸 계수22덜 민감한.

여기 우리 spectrophotometric 분석 실험을 통해 tPMET의 실시간 분석을 위한 방법 제시. 메서드 활용 서 부 표준시-1 및 DPIP, extracellular 전자 수락자로 그들은 둘 다 높은 어 금 니 소멸 계수 되 고 일반적으로 다른에 비해 덜 비싼 사용 ferricytochrome c 등 세포 외 전자 수락자. 우리는 phenazine methosulfate (PMS) 활용 Mpm 대신 그들은 유사한 화학 메이크업 및 PMS 있다 훨씬 덜 비싼. Mpm은 photochemically 안정 긴 수명이 필요로 하는 상용 키트에 대 한 중요 한 특성입니다. 그러나, 우리가 있도록 PMS 신선한 각 분석 결과 대 한 안정성 문제 해서는 안됩니다. 우리는 또한 가능한 효소 사이 상호 작용 ( 그림 1참조) extracellular 전자 수락자와 더 tPMET의 과정을 특성화 하기 위해 활용 될 수 있습니다 효소를 평가 하는 방법을 제시. 특히, 효소 AO와 잔디를 사용할 수 있습니다 어떤의 tPMET 부분은 하는데 전송 또는 extracellular superoxide 릴리스, 원형질 막에 걸쳐 수송 될 전자에 대 한 두 가지 일반적인 방법 결정 합니다.

Protocol

참고:에 대 한 주요 단계 도식 개요 그림 1 을 참조 하십시오. 1. 서 부 표준시-1 감소 분석 결과 성장 하 고 96 잘 접시 행 A-f.를 활용 하 여 표준 셀 문화 절차7 을 사용 하 여 C2C12 부착 세포 분화 구성 된 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 2% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스 보충 차별화 매체를 사용 합니다. 5% CO2<…

Representative Results

통계는 RStudio 통계 소프트웨어25를 사용 하 여 반복된 측정 ANOVA와 수행 했다. 샘플 크기는 그림 범례에 표시 됩니다. 모니터 tPMET, C2C12 myotubes extracellular 전자 수락자, 서 부 표준시-1 및 DPIP 함께 활용 했다. AO는 서 부 표준시-1의 부분을 결정 하는 데 사용 되었다, DPIP 감소 하는데 경과 예정 이었습니다 그리고 ?…

Discussion

우리는 세포 외 전자 수락자, DPIP, 및 서 부 표준시-1 tPMET C2C12 myotubes에서 모니터링 하는 spectrophotometric 분석 실험에 활용 하는 두 가지 방법 제시. 표준 문화 절차에 셀 라인의 성장과 플레이트 리더를 분 광 광도 계 분석 결과 간단한 microplate에에서 이러한 전자 수락자와 tPMET 모니터링 가능 하다. 서 부 표준시-1 감소는 잘-투-잘 분석 결과, 내에서 재현할 수 이지만 일상적인 변화. PBS는 버퍼를 활용 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 그들의 기술 지원에 대 한 토마스 벨, 린 Mattathil, 마크 Mannino, 및 Neej 파 텔에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 조나단 피셔 국립 연구소의 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 (NIDDK)에서 미국 공중 보건 봉사 상 R15DK102122에 의해 지원 되었다. 원고 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시는 NIDDK 또는 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

Materials

C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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Citer Cet Article
Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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