Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição
Summary
O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.
Abstract
Transporte de elétrons da membrana trans-plasma (tPMET) desempenha um papel na proteção das células do stress redutivo intracelular, bem como a proteção contra danos por oxidantes extracelulares. Este processo de transporte de elétrons do redutores intracelulares para o extracelulares oxidantes não é bem definido. Aqui apresentamos os ensaios espectrofotométricos por C2C12 myotubes para monitorar tPMET utilizando os aceitadores de electrões extracelular: sal de tetrazólio solúvel em água-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP ou DCIP). Através da redução destes aceitadores de electrões, somos capazes de monitorar este processo em uma análise em tempo real. Com a adição de enzimas como ascorbato oxidase (AO) e superóxido dismutase (SOD) para os ensaios, podemos determinar qual parte do tPMET é devido à produção de exportação ou superóxido de ascorbato, respectivamente. Enquanto WST-1 foi mostrado para produzir resultados estáveis com baixo fundo, DPIP era capaz de ser re-oxidado após a adição do AO e SOD, que foi demonstrado com análise espectrofotométrica. Este método demonstra um ensaio espectrofotométrico em tempo real, multi bem, rápido, com vantagens sobre outros métodos usados para monitorar tPMET, tais como o ferricianeto (BECN) e redução de c ferricytochrome.
Introduction
A visão de que a membrana plasmática tem uma capacidade inerente redox1levou a capacidade das membranas de plasma purificadas de reduzir aceitadores de electrões. Visto anteriormente em fungos, plantas e animais, o tPMET é um processo comum a vários organismos2,3,4,5. Especificamente, este processo tem sido demonstrado em Saccharomyces cerevisiae, cenoura células, hemácias, linfócitos, osteossarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético e neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. em um processo que transporta elétrons através da membrana de plasma para reduzir oxidantes extracelulares, tPMET está envolvido em muitas funções celulares, incluindo: célula crescimento5,8, de viabilidade celular9, ferro metabolismo10, sinalização11,12,13e proteção de1514,12,do espécies reactivas de oxigénio celular. Devido ao envolvimento do tPMET em muitas funções celulares, um desequilíbrio de tPMET tem sido hypothesized para contribuir para o desenvolvimento de algumas condições graves de saúde, incluindo câncer16, doença cardiovascular,17e metabólica Síndrome de18.
Existem várias maneiras de monitorar a transferência de electrões através da membrana de plasma, mas a técnica mais utilizada é avaliar a redução de aceitadores de electrões extracelular através de ensaios colorimétricos. Aceitadores de electrões extracelular comumente usados são sais de tetrazólio, DPIP, BECN e ferricytochrome c19,20. O sal de tetrazólio mais comumente usado é um conhecido sal da segunda geração como WST-119. Este composto é mais fácil de utilizar em ensaios colorimétricos comparados com sais de tetrazólio primeira geração devido a dois grupos sulfonato, que aumentam sua solubilidade de água21. WST-1, em conjunto com o methosulfate de 1-metoxi-Fenazina aceitador elétrons intermediários (mPMS), é reduzido em eventos de transferência de elétron dois. Esta redução altera a forma oxidada fraca-colorido do WST-1 para um mais intenso, amarelo formazan20,22. WST-1 possui um coeficiente de extinção molar elevada de 37 x 103 M-1cm-1, levando a um ensaio de alta sensibilidade21,22. DPIP é também utilizado como um aceitador do elétron extracelular para monitorar tPMET. Tem sido demonstrado que DPIP pode ser diminuído extracelularmente tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário23,24. Devido à falta de aceitadores de electrões intermediário, DPIP pode diretamente a pick-up os elétrons da membrana plasmática, ao contrário do WST-124. Semelhante a DPIP, BECN foi mostrado para ser diminuído extracelularmente para ferrocianeto de tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário19,24. Ao contrário do WST-1 e DPIP, BECN tem um coeficiente de extinção molar baixa, levando a uma baixa de sensibilidade de ensaio9. Outra aceitador de electrões extracelular comumente usados para monitorar tPMET é c ferricytochrome semelhante a WST-1, ferricytochrome c redução aumenta com o uso do aceptor de elétrons intermediários, mPMS22. Ao contrário do WST-1, o método de ferricytochrome c é menos sensível devido a um fundo elevado e um coeficiente de extinção molar baixa22.
Aqui nós apresentamos um método de análise em tempo real de tPMET através de ensaios espectrofotométricos. O método utilizado os aceitadores de electrões extracelular WST-1 e DPIP, que tenham um coeficiente de extinção molar alta enquanto ser menos caro em comparação com o outro comumente usado aceitadores de electrões extracelular como ferricytochrome c. Utilizamos o methosulfate Fenazina (PMS) em vez de mPMS têm uma composição química semelhante e PMS é muito menos dispendioso. mPMS fotoquimicamente estável que é uma característica importante para um kit comercial que tem uma vida útil longa. No entanto, fazemos PMS fresco para cada ensaio, por estabilidade não deve ser um problema. Também apresentamos um método para avaliar possíveis interações enzimáticas (ver Figura 1) entre o aceitador de electrões extracelular e enzimas que podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais o processo de tPMET. Especificamente, as enzimas AO e SOD podem ser usado determinam qual parte do tPMET é devido ao transporte de ascorbato ou liberação de superóxido extracelular, dois métodos comuns para elétrons ser transportado através da membrana plasmática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos dois métodos para a utilização de aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP, em ensaios espectrofotométricos para monitorar tPMET em C2C12 myotubes. Com o crescimento de linhagens celulares em procedimentos padrão de cultura e um leitor de placa de espectrofotômetro, é possível monitorar tPMET com estes aceitadores de electrões em um ensaio de microplacas simples. WST-1 redução é reprodutível de para-bem dentro de um ensaio, mas não há variabilidade do dia a dia. O dia-a-coeficiente…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer seu apoio técnico Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de serviço de saúde pública dos Estados Unidos R15DK102122 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças do rim (NIDDK) e digestivo para Jonathan Fisher. O conteúdo do manuscrito é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDDK ou o National Institutes of Health.
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
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