Här beskriver vi metoder med snurrande bricka konfokalmikroskopi bild enda fagocytos händelser av mus bosatt peritoneal makrofager. Protokoll som kan utökas till andra Fagocytos celler.
Fagocytos spelar en nyckelroll i värd försvar samt i vävnad utveckling och underhåll, och innebär snabb, receptormedierad rearrangements av aktin cytoskelettet att fånga, omsluta och uppsluka stora partiklar. Även om fagocytos receptorer, nedströms signalvägar och effektorer, såsom Rho GTPases, har identifierats, dynamisk cytoskeletal ombyggnaden av specifika receptormedierad fagocytos händelser förblir oklart. Fyra decennier sedan, två distinkta verkningsmekanismer fagocytos, exemplifierat av Fcγ-receptorn (FcγR)- och komplettera receptor (CR) – medierad fagocytos, identifierades med hjälp av scanning electron microscopy. Bindningen av immunglobulin G (IgG)-opsonized partiklar till FcγRs utlöser den utskjutande delen av tunt membran förlängningar, som initialt bildar en så kallad fagocytos kopp runt partikeln innan det blir helt sluten och tillbakadragen i cellen. Däremot verkar komplement opsonized partiklar sjunka ner i den fagocytsystemet efter bindande att komplettera receptorer. Dessa två lägen av fagocytos, fagocytos cup bildandet och sjunker i, har blivit väl etablerade i litteraturen. Skillnaderna mellan de två lägena har dock bli suddig av rapporter som komplement-medierad fagocytos kan framkalla olika membran utskjutande delar. Med tillgängligheten av hög upplösning imaging tekniker, fagocytos analyser krävs att tillåta realtid 3D (tredimensionell) visualisering av hur specifika fagocytos receptorer medla upptaget av enskilda partiklar. Mer vanliga metoder för studier av fagocytos, såsom slutpunkt analyser, saknar möjlighet att förstå vad som händer på gränssnittet för partiklar och fagocyter. Här beskriver vi fagocytos analyser, med time-lapse spinning disk-konfokalmikroskopi, som tillåter 3D imaging enda fagocytos händelser. Dessutom beskriver vi analyser för att entydigt bild Fcγ-receptorn – eller komplettera receptor-medierad fagocytos.
Tjugo år innan Metchnikoff’s observation av fagocytos mesenchyme celler i starfish larver, 1882, och efterföljande utvecklingen av sin teori om fagocytos1, beskrivs Ernest Haeckel, 1862, omvälvning av olösligt färgämne partiklar av blod cellerna i Thetis fimbris (Tethys fimbria), en art av underprissättning sea slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Han beskrev uttryckligen membran utskjutande kuvertering partiklarna, som senare togs i cytoplasman och samlats runt cellkärnan. Mer än 100 år senare, föreslog en banbrytande studie av Kaplan att det fanns minst två morfologiskt skilda mekanismer av fagocytos2. Kaplan visade med hjälp av svepelektronmikroskopi som musen peritoneal makrofager intas en IgG-opsonized får röda blodkroppar med hjälp av tunna membran förlängningar som nått upp och tätt insvept partikeln, initialt ger upphov till en cup-liknande struktur. Fagocytos cup bildandet krävs aktin polymerisation eftersom det upphävdes av den cell-permeable svamp toxin cytochalasin B, kända för att blockera aktin dynamics3. Däremot tycktes får röda blodkroppar opsonized med komplement sjunka direkt i makrofag utan generationen av membran förlängningar, även om i vissa bilder, membran volanger kan ses i omedelbara närheten av sjunkande partiklar. Till skillnad från bildandet av fagocytos cup var komplement-medierad sjunka insenstive till cytochalasin B behandling2. I de experiment som beskrivs av Kaplan, komplement opsonization utfördes av ruvning immunglobulin M (IgM) märkt får röda blodkroppar med serum från komplement C5-brist möss, som kringgår hemolys av terminalen komplement C5-beroende komplettera komplexa.
De två lägena av fagocytos, fagocytos cup bildandet och sjunker i, identifierade av Kaplan har blivit etablerade yttrande i fält4,5,6,7,8,9 . Men Ultrahög upplösning bilderna används i den ursprungliga studien av Kaplan2, samt en liknande studie av Munthe-Kaas o.a. 10, bara ger ögonblicksbilder av fagocytos händelser. I en senaste översyn, Rougerie et al. 11 betonade att morfologiska skillnader mellan FcγR – och CR-medierad fagocytos återstår klargöras, och dessutom membran volanger har observerats under komplement-medierad partikel upptag2. Live-cell avbildning av enstaka fagocytos händelser som spänner från partikel fånga till internalisering, kombinerat med genetiskt modifierade musmodeller, kraftigt skulle kunna förbättra vår förståelse av hur fagocyter fånga och äter partiklar. En strategi kan vara att använda snabbt atomic force microscopy (AFM) som tillåter Ultrahög upplösning (10 – 20 nm) topografisk avbildning av levande celler. En snabb AFM system12 har nyligen utvecklats, som är lämplig för avbildning cell ytor snabbt med låg ljudnivå. Denna teknik har fördelen att högupplösta, topografiska och mekaniska parametrar av levande celler kan mätas med korta mellanrum (sekunder), till skillnad från svepelektronmikroskopi, vilket nödvändiggör den fixering och kritisk punkt torkning av celler. En annan metod är time-lapse 3D konfokalmikroskopi, som är allmänt tillgänglig, även om fototoxicitet och blekning är begränsande faktorer under inspelningar. Detta tillvägagångssätt är mångsidig och tillåter optisk snittning med hög rumslig upplösning och ger extra flexibilitet i märkning med en häpnadsväckande rad fluorescerande sonder, inklusive genetiskt kodade fluorescerande proteiner. Här beskriver vi fagocytos analyser med time-lapse spinning disk konfokalmikroskopi som tillåter hög spatiotemporal upplösning av specifika receptormedierad fagocytos händelser.
Den stora majoriteten av fagocytos analyser, särskilt slutpunkten och hög genomströmning analyser, ger inte visualisering av hur partiklar faktiskt fångas, höljeförsedda och förtäring. Banbrytande studier av Munthe-Kaas o.a. 10 och Kaplan2 på 1970-talet föreslog att påfallande olika cytoskeletal omorganiseringar var involverade i fagocytos av IgG-opsonized kontra komplement-opsonized partiklar (får röda blodkroppar). Här beskriver vi fagocytos analyser med hjälp av spinning disk konfokalmikroskopi som tillåter högupplösta, realtid avbildning av enstaka fagocytos händelser. Vår modell fagocytsystemet är den mus bosatt peritoneal makrofager, som kan isoleras med minimal hantering, och vi använder färska isolerade humana röda blodkroppar som partiklar. Fagocytos analyserna skulle dock kunna tillämpas på andra fagocyter, såsom mus benmärg-derived makrofager eller neutrofiler, mus makrofag cellinjer, mänskliga monocyt-derived makrofager eller perifert blod neutrofiler. När det gäller mänskliga fagocyter eller mus neutrofiler, skulle alternativ fluorescently märkt antikroppar krävas, såsom fluorescently märkt anti-CD14 antikroppar (humana monocyter/makrofager)16 eller anti-Gr-1 (Ly – 6 G) antikroppar (mus neutrofiler).
Unopsonized mänskliga röda blodkroppar, som traditionellt används får röda blodkroppar, är inert i den meningen att dessa celler inte (eller, åtminstone, mycket sällan) intas av mus peritoneal makrofager. Detta garanterar, i motsats till polystyren pärlor, låg bakgrund aktivitet. Människans röda blodkroppar kan vara bekvämt opsonized med immunglobuliner med mus IgG eller IgM monoklonala antikroppar mot CD235a (glycophorin A), en specifik markör på humana erytrocyter (röda blodkroppar) och erytroid prekursorer17, 18. i parallella analyser, fluorescently märkt antimus IgG eller IgM sekundära antikroppar kan användas för att bekräfta opsonization. IgG och IgM antikropp klasserna är hemagglutinins, ämnen (antikroppar) som orsakar röda blodkroppar agglutinerar. För att undvika agglutination, blandar vi periodvis cellsuspensionen under inkubationstiden 8 min med anti-CD235a antikropp och lägger vi blandade suspensionen direkt till en makrofag-innehållande kanal bild (Fibronektin-belagda bild) utan en TVÄTTNINGSSTEGET . Tvätta stegen innebär sedimentering av erytrocyter genom centrifugering, som starkt främjar agglutination. Innan opsonizing mänskliga röda blodkroppar, märka vi plasmamembranet med en lipofil orange/röd fluorescerande sond. Denna sond är ljust fluorescerande i början av time-lapse inspelningar, men signalen bleknar gradvis, förmodligen till stor del på grund av fotoblekning19. Dessutom, kan makrofager och Fibronektin beläggning av bilden bli svagt orange/röd fluorescerande under inspelningar. Detta problem är förmodligen på grund av otillräcklig tvättning av mänskliga röda blodkroppar efter märkning. Istället för att använda en lipofila fluorescerande plasmamembranet markör, kan mänskliga röda blodkroppar märkas med ett pH-känsliga rodamin derivat med dess amine reaktiva succinimidyl ester15,20. Detta har fördelen av att visualisering av phagosome mognad eftersom fluorescensintensiteten ökar med minskande pH15,20, men detta tillvägagångssätt har nackdelen som reaktiv ester preparat för närvarande dyra och instabil efter beredning i vattenhaltigt medium.
IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar intas via FcγRs, som kan bekräftas med peritoneal makrofager isolerade från NOTAM21 eller Fcer1g– / – (Fcer1g knockoutmöss). NOTAM makrofager binda IgG-opsonized mänskliga röda blodkroppar, men saknar ITAM (immunoreceptor tyrosin-baserad aktivering motiv) – medierad signalering krävs att inducera fagocytos, medan Fcer1g knockout makrofager inte uttrycker surface FcγRs. IgG – eller IgM-opsonized mänskliga röda blodkroppar kan vara dessutom opsonized med C3b (som är kluvna till iC3b) av ruvning cellerna med nymalen isolerade serum från en komplement C5 null mus (vildtyp serum orsakar hemolys). Opsonins IgG och IgM aktivera klassiskt komplement kaskad, vilket leder till bildandet av porer (membran attack komplex) och cellys. I möss som saknar komplement C5, komplement kaskad fortsätter att komplettera C3 klyvning, men C5 convertase saknar de substrat som krävs för att katalysera terminal vägen. Vi utvecklat enkla analyser för att mäta kineticsen av komplement kaskad. Kort sagt kan människans röda blodkroppar vara co märkta med ett rött fluorescerande, plasmamembranet markör och grön fluorescerande, cytosoliska fluorophore. Vid bildandet av membran attacken komplexa, bildas av kompletterande komponenter C5-C9, cytosoliska fluorophore är snabbt (i sekunder) förlorade från cytosolen. Visualisering av funktionen slutet-effektor (cytolys) i komplement kaskad anges att 4 min inkubationstiden är tillräcklig för C3b/iC3b opsonization av mänskliga röda blodkroppar. I parallella analyser, kan C3b/iC3b beläggning av mänskliga röda blodkroppar enkelt bedömas efter applicering en blandning av antimus C3b och fluorescently märkt sekundära antikroppar. I detta fall krävs en TVÄTTNINGSSTEGET ta bort obundna fluorescerande antikroppar. Även om tvättningen innebär cell sedimentaion genom centrifugering, som främjar agglutination, kan framgångsrika opsonization lätt bedömas konfokalmikroskopi. Komplement-medierad fagocytos kan avbildas av antingen tillämpa IgG- / iC3b-opsonized mänskliga röda blodkroppar NOTAM eller Fcer1g– / – makrofager eller genom att införa IgM- / iC3b-opsonized mänskliga röda blodkroppar till vildtyp makrofager. IgM-opsonized blodkroppar erkänns inte av den ITAM-innehållande FcγRs (FcγRI, FcγRIII och FcγRIV) krävs för fagocytos av IgG-opsonized partiklar22.
För att bilden fagocytos kan händelser, plasmamembranet av makrofager märkas med grön fluorescerande fluorophore konjugerad antikropp som anti-F4/80, som även fungerar som en specifik markör för mus makrofager. Människans röda blodkroppar kan renderas röd fluorescerande genom inkubation med en orange/röd fluorescerande plasmamembranet markör, som diskuterats ovan. Denna lipofila plasmamembranet markör undviker eventuella störande effekter av antikroppsbaserade etiketter. Röd fluorescerande mänskliga röda blodkroppar, med eller utan opsonization, kan vara direkt pipetteras i 100 µL kanalen på en kanal-bild och 3D time-lapse avbildas via en 60 X / 1,49 olja (eller liknande) objektiv som utförs med hjälp av 488 nm och 561 nm laserlinjer , respektive av en snurrande bricka confocal (eller liknande) Mikroskop. Det är frestande att optimera systemet för högupplösta imaging, men förvärvet av upprepade Z-stackar över 16 min eller så kan orsaka betydande fotoblekning och fototoxicitet. Vi valde att använda 2 x 2 binning för att främja bra signal-brus-förhållanden och möjliggöra minskningar i excitation intensitet och/eller exponeringstider, men på bekostnad av optisk upplösning. Dessutom, för att minska fototoxicitet, lägga vi en asätare av reaktiva syreradikaler till medium. I framtida studier, kunde analyserna ändras bilden fagocytos av apoptotiska mänskliga röda blodkroppar. Tillämpningen av en Ca2 + jonofor, såsom A23187, kan användas för att inducera fosfatidylserin externalisering23, en ”ät mig” signal och hallmark tidiga apoptos24,25.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidragen HA 3271/4-1 och HA 3271/4-2 från DFGEN (Deutsche Forschungsgemeinschafts), och att bevilja FF-2016-05 från EXC 1003 (kluster av Excellence 1003), celler i rörelse (CiM), DFG.
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |