Un modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina in Zebrafish adulto
Summary
Un metodo per generare un modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina in adulto zebrafish (Danio rerio) è descritto qui. Vengono presentati due modi alternativi di iniezione intraperitoneale e le condizioni per ridurre le variazioni tra i diversi gruppi sperimentali sono discusse.
Abstract
Il geneticamente accessibile adulto zebrafish (Danio rerio) è stato utilizzato sempre più come un modello di vertebrati per comprendere le malattie umane quali cardiomiopatia. Per la sua comodità e disponibilità a manipolazioni genetiche a resa elevata, la generazione di modelli acquisiti cardiomiopatia, ad esempio il modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina (DIC) in zebrafish adulto, sta aprendo le porte a nuove vie di ricerca, tra cui scoprire modificatori di cardiomiopatia tramite screening genetico in avanti. Diverso dal modello DIC zebrafish embrionali, sia iniziale acuta e poi croniche fasi di cardiomiopatia possono essere determinate nel modello zebrafish adulto DIC, consentendo lo studio dei meccanismi di segnalazione di fase-dipendente e strategie terapeutiche. Tuttavia, la variabili risultati possono essere ottenuti con il modello attuale, anche nelle mani di esperti ricercatori. Per facilitare la futura attuazione del modello DIC, presentiamo un protocollo dettagliato su come generare questo modello DIC in zebrafish adulto e descrivere due modi alternativi di iniezione intraperitoneale (IP). Più ulteriormente discutiamo le opzioni su come ridurre le variazioni per ottenere risultati affidabili e fornire suggerimenti su come interpretare correttamente i risultati.
Introduction
Doxorubicina (DOX), anche denominato adriamicina, è stato sviluppato come un farmaco anti-tumorale dai anni 19601,2. Ora è ancora attivamente usato come un farmaco chemioterapico importante per un ampio spettro di tumori. Tuttavia, applicazione clinica di DOX è stata ostacolata dalla sua tossicità dose-dipendente, soprattutto cardiotossicità caratterizzata da sintomi variabili che vanno da cambiamenti elettrocardiografici asintomatici a pericardite e scompensata cardiomiopatia 1 , 2. ad oggi, almeno tre ipotesi principali sono state sollevate per spiegare DIC, tra cui attivato reattive dell’ossigeno (ROS) specie1,3,4,5, inibizione della topoisomerasi II-β ( TOP2β)6,7e la modulazione del calcio intracellulare rilasciare1,8,9. Raccogliendo la prova suggerisce anche la predisposizione genetica come fondamentale fattore di rischio per DIC10,11,12,13. Identità di gene relativo a queste predisposizioni di DIC, tuttavia, rimangono in gran parte sconosciuti. Dexrazoxano è l’unico agente adiuvante approvato per la US Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento di DIC, ma con limitata attuazione14,15,16, sottolineando la necessità di individuare ulteriori strategie terapeutiche. Modelli animali di DIC sono quindi esplorati per questi scopi. A causa della loro semplicità e accessibilità, studi meccanicistici su modelli DIC potrebbero avere conseguenze più ampie su altri tipi di cardiomiopatie: patogenesi comune potrebbero essere condivisa tra cardiomiopatie delle eziologie differenti, soprattutto a seguito fasi patologiche17,18,19,20.
Oltre ai modelli del roditore di DIC, modelli DIC zebrafish con un throughput più elevato sono stati sviluppati per facilitare la scoperta di nuovi fattori genetici e di terapeutica. Un modello embrionale di DIC è stato stabilito negli embrioni di zebrafish trasparente per lo screening di composti terapeutici21. Dato che le cardiomiopatie sono malattie di inizio adulto con una patogenesi progressiva, cardiomiopatia di zebrafish adulto modelli sono stati sviluppati22,23,24,25,26. Abbiamo generato il primo modello acquisito per cardiomiopatia derivanti da anemia cronica24, seguita da DIC come il secondo modello di cardiomiopatia acquisite in zebrafish adulto23. Abbiamo trovato che l’iniezione di un singolo bolo di DOX in zebrafish adulto induce la cardiotossicità che consiste in una fase acuta all’incirca entro 1 settimana post-iniezione (wpi), seguita da una fase cronica di cardiomiopatia post-all’iniezione 6 mesi. Mentre aploinsufficienza del meccanicistico bersaglio della rapamicina(mtor) migliora la cardiomiopatia nella fase cronica, si esagera mortalità dei pesci alla fase acuta, sottolineando il valore del modello adulto DIC a discernere fase-dipendente meccanismi di23. Abbiamo inoltre dimostrato che il modello DIC adulto può essere utilizzato per sollecitare una raccolta di zebrafish cardiaco (ZIC) mutanti inserzionali che vengono generati tramite un approccio basato su trasposone mutagenesi inserzionale27. Un pilota schermo identificato 3 geni noti cardiomiopatia così come DnaJ (Hsp40) omologo, sottofamiglia B e membro 6b (dnajb6b) come nuova DIC suscettibilità geni28. Di conseguenza, la generazione del modello adulto DIC in zebrafish hanno portato a una nuova metodologia che sistematicamente consente l’identificazione di geni modificatori per DIC, che integra il studio di associazione genome-wide esistente (GWAS) e quantitative trait locus (QTL ) analisi.
Durante la generazione e l’attuazione del modello DIC zebrafish adulto, abbiamo notato variazioni significative tra i diversi ricercatori e/o anche tra diverse iniezioni eseguite dallo sperimentatore stesso. La natura longitudinale del modello impone sfide alla registrazione risultati da diversi ricercatori e al processo di risoluzione dei problemi sequenza. Per facilitare l’uso di questo semplice metodo di stress che inducono cardiomiopatia di comunità di ricerca, descriviamo il nostro protocollo in dettaglio, presenti due tipi di iniezione del IP e discutere considerazioni per ridurre le variazioni tra i diversi ricercatori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per modellare un DIC progressivo, la dose di 20 mg/kg DOX è stata determinata sperimentalmente come la dose massima che non provoca morte significativa dei pesci durante 1 wpi ma ancora risultati nella morte dei pesci e la riduzione della funzione cardiaca dopo 4 wpi (Figura 3 e Figura 4). Questa dose è paragonabile a quelli frequentemente utilizzati nei modelli del roditore di DIC (15-25 mg/kg) e la dose cumulativa di limite in esseri umani (550 mg/m2</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di sviluppo scienziato dal Associazione americana del cuore (14SDG18160021 a YD), gli Stati Uniti NIH R01 concede HL 81753 e HL 107304 a XX e la Fondazione di Mayo a XX.
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
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