En metode for å generere en doksorubicin-indusert kardiomyopati modell i voksen sebrafisk (Danio rerio) er beskrevet her. To alternative måter å intraperitoneal injeksjon presenteres og forhold til å redusere variasjoner blant annet eksperimentelle diskuteres.
Den genetisk tilgjengelig voksen sebrafisk (Danio rerio) har blitt stadig mer brukt som virveldyr modell for å forstå menneskelig sykdommer som kardiomyopati. På grunn av sin bekvemmelighet og amenability til høy gjennomstrømning genetisk manipulasjon, åpner generering av ervervet kardiomyopati modeller, som doksorubicin-indusert kardiomyopati (DIC) modellen i voksen sebrafisk, dørene til nye forskning muligheter, inkludert oppdage kardiomyopati modifikatorer via frem genetisk screening. Forskjellig fra embryonale sebrafisk DIC modellen, både første akutt og senere kronisk faser av kardiomyopati kan bestemmes i voksen sebrafisk DIC modellen muliggjør studiet av scenen-avhengige signalnettverk mekanismer og strategier. Imidlertid kan variable resultater oppnås med den gjeldende modellen, selv i hendene på erfarne etterforskere. For å lette framtidige gjennomføringen av DIC modell, presenterer vi en detaljert protokoll å generere denne DIC modellen i voksen sebrafisk og beskrive to alternative måter å intraperitoneal (IP) injeksjon. Vi diskutere ytterligere alternativer på Hvordan redusere varianter for å få pålitelige resultater og gi forslag på hvordan riktig tolke resultatene.
Doksorubicin (DOX), også kalt Adriamycin, har blitt utviklet som en anti-neoplastic narkotika siden 1960-tallet1,2. Det er nå fortsatt aktivt brukes som en viktig chemotherapeutic stoff for et bredt spekter av svulster. Men klinisk anvendelse av DOX ble hindret av sine doseavhengig toksisitet, spesielt Kardiotoksisitet variabel symptomer mellom asymptomatiske electrocardiographic endringer Perikarditt og dekompensert kardiomyopati 1 , 2. dato minst tre store hypoteser har vært reist for å forklare DIC, inkludert aktivert reaktive oksygen arter (ROS)1,3,4,5, hemming av topoisomerase II-β ( TOP2β)6,7og modulering av intracellulær kalsium slipper1,8,9. Samler bevis også foreslår genetisk predisposisjon som en avgjørende risikofaktor for DIC10,11,12,13. Gene identiteter knyttet til disse DIC predisposisjoner, beholdes imidlertid stort sett ukjent. Dexrazoxane er den eneste adjuvant agenten godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for å behandle DIC, men med begrenset implementering14,15,16, understreker behovet for å identifisere flere strategier. Dyr modeller av DIC er derfor utforsket for disse formålene. På grunn av sin tilgjengelighet og enkelhet, mekanistisk studier på DIC modeller kan potensielt har bredere virkninger på andre typer cardiomyopathies: felles patogenesen kan deles blant cardiomyopathies av forskjellige etiologies, spesielt i senere patologisk stadier17,18,19,20.
I tillegg til gnager modeller av DIC, er sebrafisk DIC modeller med høyere gjennomstrømming utviklet for å lette oppdagelsen av både nye genetiske faktorer og therapeutics. En embryonale DIC modell er etablert i gjennomsiktig sebrafisk embryo for screening terapeutiske forbindelser21. Gitt at cardiomyopathies voksen utbruddet sykdommer med en progressiv patogenesen, utviklet voksen sebrafisk kardiomyopati modeller har vært22,23,24,25,26. Vi utviklet den første ervervede modellen for kardiomyopati skyldes kronisk anemi24, etterfulgt av DIC som andre ervervet kardiomyopati modell i voksen sebrafisk23. Vi fant at injeksjon av en enkelt bolus av DOX i voksen sebrafisk induserer Kardiotoksisitet som består av en akutt fase omtrent innen 1 uke etter injeksjon (wpi), etterfulgt av en kronisk fase av kardiomyopati til 6 måneder etter injeksjon. Mens haploinsufficiency av mekanistisk målet på rapamycin(mtor) ameliorates kardiomyopati på den kroniske fasen, overdriver den fiskedød på den akutte fasen, understreker verdien av voksen DIC modellen å skjelne scenen-avhengig mekanismer23. Vi viste videre at voksen DIC modellen kan brukes til en rekke sebrafisk insertional hjerte (ZIC) mutanter som genereres via en transposon-baserte insertional mutagenese tilnærming27. En pilot skjerm identifisert 3 kjent kardiomyopati gener samt DnaJ (Hsp40) homolog, gruppe B og medlem 6b (dnajb6b) som nye DIC mottakelighet gener28. Derfor generering av voksen DIC modellen i sebrafisk førte til en ny metodologi som systematisk gjør identifikasjoner av genetisk modifikatorer DIC, som utfyller den eksisterende genomet hele foreningen studie (GWAS) og kvantitative egenskap locus (QTL ) analyse.
Under generasjon og implementering av voksen sebrafisk DIC modellen, la vi merke til betydelige variasjoner blant ulike forskere og/eller selv blant annerledes innsprøytninger utført av den samme etterforskeren. Langsgående natur modellen pålegger utfordringer å registrere resultatene fra forskjellige etterforskere og sekvensiell feilsøkingsprosessen. For å lette bruken av denne enkle kardiomyopati-inducing stress metoden av forskningen fellesskapet, vi beskrive våre protokollen, finnes to typer IP injeksjon, og diskutere hensyn for å redusere variasjoner blant ulike forskere.
For å modellere en progressiv DIC, identifiserte dosen av 20 mg/kg DOX eksperimentelt som høyeste dosen som ikke forårsaker betydelig fisk død under 1 wpi men fortsatt resultater i fisk død og reduksjon av hjertefunksjon etter 4 wpi (Figur 3 og Figur 4C). Denne dose sammenlignes de brukte i gnager DIC modeller (15-25 mg/kg) og grense kumulative dosen hos mennesker (550 mg/m2, noe som tilsvarer 15 mg/kg)4,<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet var støttes delvis av en forsker Development Grant fra American Heart Association (14SDG18160021 til YD), amerikanske NIH R01 gir HL 81753 og HL 107304 til XX, og Mayo grunnlaget til XX.
Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |