深い皮膚注入として、モデルカンジダ皮膚感染症病理組織学的解析のための
Summary
ここでカンジダ皮内注射後皮膚サンプルの組織学的および分子の解析を可能にするプロトコルについて述べる。このプロトコルは、皮膚の構造的な整合性を維持でき、病原体の分布と同様、組織居住者や新人の免疫細胞の局在化のため。
Abstract
皮膚は体の非常に拡張された器官、この大きい表面のため継続的に微生物にさらさ。肌のダメージは有効で、血液中に病原体の普及の結果、真皮で感染症に簡単につながります。どのように非常に早い段階で感染症と戦う免疫システムとどのようにホストが病原体を排除することができます理解することは、将来の治療介入のベースを設定する重要なステップです。ここで述べるなど病原体がc. アルビカンスによって誘発される免疫応答と同様に、上皮のバリアを超えたとき、感染症の初期段階で発生するプロセスを視覚化することができますカンジダ感染症のモデルの侵略。皮膚と同様の存在と病原体の局在に潜入免疫細胞を示す組織学的解析を実行するのにこの感染モデルを使用しました。採取後 RNA 抽出のため感染を処理ことができます。
Introduction
人間の体は、微生物数が非常に高いで覆われています。皮膚表面は、1平方センチメートルあたりほぼ 100 万の細菌の生息地です。ただし、この数は皮膚を定着する微生物のさまざまなを反映しません。細菌だけでなく人間の体は、粘膜と皮膚のレベル2の両方を存続することができるc. アルビカンスを含む多くの菌種によって植民地化します。
近年では、真菌感染症と診断された人の割合は非常に増加しています。これは主に免疫不全者、すなわち、HIV 陽性の患者、移植3の後に化学療法や免疫抑制薬を経て患者数の増加。アメリカ合衆国で行われた監視調査、Wisplinghoffらは、院内血流感染症の 9.5% がカンジダ種4によって引き起こされたことを示した。真菌感染症とカンジダ血流感染症の中に発見の上昇の割合、特にのための高められた発生、ためこの病原体が免疫系の制御をエスケープする方法を理解することは非常に大事な。
C. アルビカンスは、酵母、blastospores、桑、5環境条件に応じて菌糸など異なる形態で育つ二形性真菌です。菌糸形態、 C. albicansはその侵襲性の最大容量を示しています、上皮6を貫通する能力を持っています。
C. アルビカンスの感染症は、いくつかの実験的アプローチを使用して研究されています。感染症の最も一般的なモデルは、 C. albicans酵母7の静脈注射です。ただし、このモデルはない考慮すべてのプロセスが起こる菌が血流に広がる管理する前に。別のモデルでは、上皮に侵入するC. albicansの機能を活用します。このメソッドでは、またとして知られている砂のペーパー モデル81998年9Gaspariらによって開発された、こうしてc.albicansを適用する前に角質を除去、肌を研磨する砂のペーパーを使用して成っています。この手順では、この病原体の侵襲的な能力の分析ができ、上皮に侵入する菌をことができます。最後に、消化管10と11気道感染症の他のモデルは、さまざまな研究で使用されています。
(砂のペーパー モデル) のように傷の形成は、癒しのプロセス12を促進するために免疫細胞の動員と活性化を含む、いくつかの経路の活性化を引き起こします。変更、または具体的結果を交絡につながる、病原体に対して誘発される免疫応答をマスクできます。
ここで初期傷の形成を回避する皮膚感染症法と基底炎症性環境の誘導について述べる。そのまま上皮構造を維持するために直接、菌糸形深いダーマでc. アルビカンスを挿入します。炎症の量が制限され、制限されているにもかかわらず、単一の注入は、軽度の炎症を引き出すことができる、砂のペーパー モデルのように開いた傷の形成と比較して。我々 はここで説明するアプローチには、真菌感染症と機械的な損傷によって引き起こされる過度なと既存の炎症性環境を回避しながら普及に免疫応答の研究ことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで深いダーマの真菌の入口に開始される炎症過程を研究するC. albicans感染症法について述べる。
深いダーマで直接菌の注入により駆動型真菌膿瘍形成の研究だけでなく、特定の免疫の解析、皮膚膿瘍形成はC. albicans感染15時に比較的まれなイベントが、真菌を含む参加細胞は します。ここで説明する方法、それは機械的破損や傷、炎症?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FG は、ラ Ricerca スル Cancro (IG 2016Id.18842) あたり Associazione イタリアーナ、Cariplo 財団 (助成 2014年-0655) とラ Ricerca Biomedica (FRRB) あたりスタンパーリアラヴェッロ オルシによってサポートされます。
IZ は、NIH グラント 1R01AI121066 01A1, 1R01DK115217, マルチカメラ P30 DK034854 グラント、発見したハーバード医療学校ミルトン、CCFA シニア研究賞 (412708)、エレノア、マイルの海岸に支えられて 50 周年記念フェローシップ プログラムと Cariplo 財団 (2014-0859)。
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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