Elektrokemisk detektion af Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektron Transport i Shewanella oneidensis hr.-1
Summary
Her præsenterer vi en protokol af hele-celle elektrokemiske eksperimenter til at studere bidrag af proton transport til sats af ekstracellulære elektron transport via de ydre membran cytokromer, der i Shewanella oneidensis hr.-1.
Abstract
Direkte elektrokemisk detektion af c-Skriv cytokrom komplekser indlejret i den bakterielle ydre membran (ydre membran c-Skriv cytokrom komplekser; OM c– Cyts) har for nylig dukket op som en roman hele-celle analytisk metode til at karakterisere den bakterielle elektron transport fra respiratorisk kæden til celle udvendige, kaldes den ekstracellulære elektron transport (EET). Mens pathway og kinetik af elektron flow under EET reaktion er blevet undersøgt, er en helhed-celle elektrokemiske metode til at undersøge virkningen af kation transport forbundet med EET endnu ikke fastlagt. I den foreliggende undersøgelse, et eksempel på en biokemisk teknik til at undersøge deuterium kinetic isotop effekt (KIE) på EET gennem OM c– Cyts ved hjælp af en model mikrobe, Shewanella oneidensis hr.-1, er beskrevet. KIE på EET processen kan opnås, hvis EET gennem OM c– Cyts fungerer som den trafikhastighedsbegrænsning trin i den mikrobielle nuværende produktion. Herpå, før tilsætning af D2O, blev supernatanten løsningen erstattet med friske medier indeholdende en tilstrækkelig mængde af elektron donoren støtte sats af upstream metaboliske reaktioner og fjerne de planktoniske celler fra en ensartet éncellelag biofilm på arbejde elektrode. Alternative metoder til at bekræfte hastighedsbegrænsende trin i mikrobiel nuværende produktion som EET gennem OM c– Cyts er også beskrevet. Vores teknik af en helhed-celle elektrokemisk analyse for at undersøge proton transport kinetik kan anvendes til andre electroactive mikrobielle stammer.
Introduction
Elektrokemiske teknikker til direkte karakterisere en redox protein i en intakt bakteriel celle er for nylig opstået siden opdagelsen af metal-reducerende mikrobielle stammer, såsom S. oneidensis hr.-1 eller Geobacter svovlreducens PCA, som har ydre membran c-type cytokrom komplekser (OM c-Cyts) udsat for celle udvendige1,2,3,4,5. OM c– Cyts mægle elektron transport fra den respiratoriske kæde på solid substrater beliggende extracellularly. Denne transport er benævnt ekstracellulære elektron transport (EET)1,6 og er en kritisk proces for nye bioteknologier, såsom mikrobielle brændselsceller6. Derfor, for at forstå de underliggende EET kinetik og mekanismer og dens forbindelse til mikrobiel fysiologi, OM c –Cyts er blevet undersøgt ved hjælp af hele-celle elektrokemi4,7, kombineret med mikroskopi 8 , 9, spektroskopi10,11, og molekylærbiologi2,4. Derimod har at undersøge virkningen af EET-associerede kation transport, fx protoner på EET kinetik i levende celler været næppe fastlaegges metoder, trods proton transport på tværs af bakteriel membraner har en afgørende rolle signalering, homøostase, og energi produktion12,13,14. I nuværende undersøgelse, vi beskriver en teknik til at undersøge virkningen af proton transport på EET kinetik i S. oneidensis hr.-1 celle ved hjælp af hele-celle elektrokemiske målinger, som kræver en identifikation af de hastighedsbegrænsende trin i mikrobielle nuværende produktion15.
En direkte måde at evaluere bidrag af proton transport på den tilknyttede EET er deuterium kinetic isotop effekt (KIE). KIE er observerbare som ændringen i elektron overførsel kinetik ved udskiftning af protoner med deuterium ioner, hvilket svarer til virkningen af proton transport elektron overførsel kinetik16. Teorien om KIE selv er blevet godt etableret, ved hjælp af elektrokemiske målinger med renset enzymer17. Men da nuværende produktion i S. oneidensis hr.-1 resultater fra flere, forskellige og svingende processer18, ikke en blot identificere EET som trafikhastighedsbegrænsning processen. Observere KIE på proton transport processer kombineret med EET, vi har brug at bekræfte, at den mikrobielle nuværende produktion er begrænset af elektron transport via OM c– Cyts til elektrode. Til dette formål erstattet vi den supernatanten løsning med friske medium, der indeholder en høj koncentration af laktat som en elektron donor på optimale pH og temperatur betingelser før KIE måling; denne udskiftning serveret to roller: (1) det forbedret satsen af upstream metaboliske processer i forhold til EET, og (2) udeladt svømning celler i supernatanten frigivet fra éncellelag biofilm af S. oneidensis hr.-1 på arbejde elektrode ( indium tin-doped oxid (ITO) elektrode). Fremlagt detaljerede protokollen er beregnet til at hjælpe nye udøvere fastholde og bekræfte, at EET proces er det hastighedsbestemmende trin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores hele-celle elektrokemisk analyse har adskillige tekniske fordele sammenlignet med protein elektrokemi. Mens protein oprensning kræver flere trin tidskrævende procedurer, tager vores hele-celle metode en dag af Self-Organized Biofilmdannelse efter cellekultur. For at opnå en stabil interaktion mellem OM c– Cyts og elektrode, vi behøver kun sterilisation og rengøring af elektrode overflade; Det kræver ikke elektrode ændring for organisering orientering af proteiner4, f.eks….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev økonomisk støttet af en licensbetaling for specielt fremmes forskning fra Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP’ER) KAKENHI tilskud antal 24000010, 17H 04969, og JP17J02602, den os Office af Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. er en JSP’ER Research Fellow og støttet af JSP’ER gennem programmet for førende Graduate skoler (MERIT).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration – Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
