Électrochimique détection de cinétique effet isotopique sur extracellulaire Transport d’électrons dans Shewanella oneidensis MR-1

Summary

Nous présentons ici un protocole d’expériences électrochimiques cellule entière pour étudier la contribution du transport de protons au taux de transport des électrons extracellulaire par les cytochromes de la membrane externe complexes de Shewanella oneidensis MR-1.

Abstract

Direct de détection électrochimique de c-type incorporés dans la membrane externe bactérienne du cytochrome complexes (membrane externe c-type du cytochrome complexes ; OM c- Cyts) a récemment émergé comme nouvelle méthode analytique cellule entière pour caractériser le transport des électrons bactérien de la chaine respiratoire à l’extérieur de la cellule, dénommé le transport des électrons extracellulaire (EET). Alors que la voie et la cinétique de l’écoulement d’électron au cours de la réaction de EET ont été étudiés, une méthode électrochimique cellule entière pour examiner l’impact du transport de cations associé à EET n’a pas encore été établie. Dans la présente étude, un exemple d’une technique biochimique pour examiner l’effet isotopique deutérium (KIE) sur EET par OM c- Cyts utilisant un microbe modèle, Shewanella oneidensis MR-1, est décrite. L’EIC sur le processus EET peut être obtenue si l’EET par OM c- Cyts agit comme l’étape cinétiquement limitante dans la production actuelle microbienne. À cette fin, avant l’ajout de D₂O, le surnageant a été remplacé avec les supports neufs contenant une quantité suffisante de donneur d’électrons pour soutenir le taux de réactions métaboliques en amont et de retirer les cellules planctoniques un uniforme monocouche biofilm sur l’électrode de travail. Méthodes alternatives pour confirmer la limitante étape dans la production actuelle microbienne comme EET par OM c- Cyts sont également décrites. Notre technique d’un dosage électrochimique cellule entière pour étudier la cinétique du transport proton peut être appliquée à d’autres souches microbiennes électroactif.

Introduction

Des techniques électrochimiques de qualifier directement une protéine d’oxydo-réduction dans une cellule bactérienne intacte ont récemment émergé depuis la découverte de souches microbiennes-réduction des métaux, tels que S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, qui ont des complexes de cytochrome c-type de membrane externe (OM c-Cyts) exposés à la cellule extérieur^1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts médiation transport des électrons de la chaine respiratoire à des substrats solid....

Protocol

1. formation d’un Biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 sur une électrode ITO (Figure 1)

Remarque : Pour éviter la contamination du réacteur électrochimique avec d’autres microbes, tous les médias, outils et composants du réacteur électrochimique doivent être stérilisés à l’avance. Quand à l’aide de cellules de S. oneidensis MR-1 et la construction des réacteurs électrochimiques, toutes les procédures doivent être réalisées sur un banc propre.

1. Culture de cellules de S. oneidensis MR-1
   Remarque : Un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 a été formé sur l’OIC....

Results

Après 25 h de demande potentielle, à + 0,4 V (par rapport à elle), un biofilm monocouche a été formé sur l’électrode de travail du verre ITO, qui a été précédemment confirmée par un microscope électronique à balayage ou une microscopie confocale⁴. L’évolution temporelle représentatifs de la production actuelle de M. S. oneidensis -1 lors de la formation d’un biofilm monocouche est montrée dans la Figure 2. Bien que le courant .......

Discussion

Notre essai électrochimique cellule entière a plusieurs avantages techniques par rapport à l’électrochimie de protéine. Tandis que la purification de la protéine nécessite des procédures fastidieuses multi-étapes, notre méthode de cellule entière prend une journée de formation de biofilm auto-organisé après culture cellulaire. Pour parvenir à une interaction stable entre OM c- Cyts et l’électrode, nous avons besoin seulement de stérilisation et de nettoyage de la surface de l’électrode ; il ne nécessite pas de m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cylindre en verre	N/A	N/A	Sur mesure, utilisé comme
couvercle et base en PTFE	N/A	N/A	Fabrication sur mesure, utilisé comme couvercle et base du réacteur électrochimique
Caoutchouc buthyle	N/A	N/A	Sur mesure, inséré entre chaque composant du réacteur électrochimique
Septa	GL Science	3007-16101	Utilisé comme orifice d’injection d’un réacteur électrochimique
Électrode d’oxyde dopé à l’indium et à l’étain (ITO)	GEOMATEC	n° 0001	Utilisé comme électrode de travail, électrode saturée 5&Omega ;/
sq Ag/AgCl KCl	HOKUTO DENKO	HX-R5	Utilisé comme électrode de référence, &Phi ; Fil de platine de 0,30 mm
	The Nilaco Cooporation	PT-351325	Utilisé comme contre-électrode
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller	Becton, Dichkinson and Company	244620	Milieu pour la préculture de S. oneidensis MR-1
Gélose Bacto	Becton, Dichkinson and Company	214010
Anthraquinone-1-sulfonate (&alpha ;-AQS)	TCI	A1428
Flavin mononucléotide (FMN)	Wako	184-00831
NaHCO3	Wako	191-01305	Utilisé pour les milieux définis (DM)
CaCl2 · ; 2H2O	Wako	031-00435	Utilisé pour DM
NH4Cl	Wako	011-03015	Utilisé pour DM
MgCl2 · ; 6H2O	Wako	135-00165	Utilisé pour DM
NaCl	Wako	191-01665	Utilisé pour
l’acide éthanesulfonique DM 2-[4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl] (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Utilisé pour la
solution de lactate de sodium	DM Wako	195-02305
Extrait de levure Bacto	Becton, Dichkinson and Company	212750
Oxyde de deutérium (D, 99,9 %)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Additif pour les expériences d’effet isotopique cinétique
Incubateur	TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.	LTI-601SD	Utilisé pour la pré-culture
Shaker	TAITEC	NR-3	Utilisé pour la pré-culture
Machine autoclave	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Utilisé pour la stérilisation du réacteur électrochimique et du milieu
Banc propre	SANYO	MCV-91BNF	Utilisé pour prévenir la contamination du réacteur électrochimique et du milieu par d’autres microbes
Séparateur	Eppendorf	5430R	Vitesse de rotation jusqu’à 6000× ; g est nécessaire
Générateur d’azote gazeux	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	La bouteille d’azote gazeux peut également être utilisée à la place du générateur de gaz
Spectromètre UV-vis	SHIMADZU	UV-1800	Utilisé pour l’optimisation de la densité cellulaire
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Utilisé pour la formation de biofilms et les expériences d’effet isotopique cinétique
Circulateur d’eau thermique	AS ONE	TR-1A	Utilisé pour le maintien de la température du réacteur électrochimique
Cage de Faraday	HOKUTO DENKO	HS-201S	Utilisée pour les expériences électrochimiques