電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送
Summary
ここで全細胞外膜シトクロムシェワネラ oneidensis氏-1 複合体を介して細胞外の電子輸送の速度へのプロトン輸送の貢献を研究する電気化学実験のプロトコルを提案する.
Abstract
直接cの電気化学的検出-細菌の外膜に埋め込まれているシトクロム複合体を入力 (外膜c-シトクロム複合体; を入力OM c– 假) が最近セル外部へ呼吸の鎖からの細菌の電子輸送を特徴付ける新規細胞分析法として登場、細胞外の電子輸送 (EET) と呼ばれます。経路と EET 反応の間に電子流の動態を調べた、一方 EET に関連付けられている陽イオン輸送の影響を調べる全細胞の電気化学的手法はまだ確立されていません。本研究では、重水素同位体効果 (キエ) EET の OM cを調べる生化学的手法の例 – 假モデル微生物、シェワネラ oneidensis氏-1, を使用して、説明します。OM cを介して EET – 假微生物の現在の生産の率制限ステップとして機能する場合、EET プロセスに KIE を取得できます。そのため、D2O は、加算の前に上澄みが上流の代謝反応の速度をサポートし、ユニフォームから浮遊性のセルを削除する電子供与体の十分な量が含まれている新鮮なメディアに置き換えられました作用電極上の単分子膜バイオ フィルム。レート制限を確認する方法は、微生物の現在の生産のステップ – 假 OM cを介して EET として述べる。プロトン輸送の動力学を調査するため細胞の電気化学的アッセイの我々 の手法は、他の電気活性微生物系統に適用できます。
Introduction
S. oneidensis氏 1、 Geobacter sulfurreducens 、PCA など、金属還元微生物菌株が発見されて以来そのままの細菌の細胞の酸化還元タンパク質を直接特徴付けるため電気化学的手法が近年します。外膜 c 型チトクロム複合体 (OM c 假) セル外観1,2,3,4、5の露出があります。OM c– 假は、呼吸鎖から細胞外に位置する固体基板上への電子輸送を仲介します。このトランスポートは、細胞外の電子輸送 (EET)1,6と呼ばれ、新興のバイオ テクノロジー、微生物燃料電池6などの重要なプロセスです。したがって、基になる EET の速度論と機構、および微生物生理学へのリンクを理解する OM c –假を用いて調べた細胞電気化学4、7顕微鏡と組み合わせて8,9、分光10、11、および分子生物学2,4。対照的に、EET 関連する陽イオン輸送など陽子 EET 細胞内動態の影響を調査する方法確立されているやっとのこと重要な役割を持つ細菌の膜を渡るプロトン輸送にもかかわらずシグナリング、恒常性とエネルギー生産12,13,14。本研究で、細胞電気化学測定法を使用しての率制限ステップの id を必要とするs. oneidensis氏 1 セルの EET 動力学に関するプロトン輸送の影響を調査する手法について述べる微生物現在生産15。
関連付けられた EET のプロトン輸送の貢献を評価する直接方法の 1 つは重水素同位体効果 (キエです)。KIE 電子転送速度16プロトン輸送の影響を表す重水素イオン、プロトンの交換時に電子伝達速度の変化として観察可能であります。KIE 自体の理論定着させてきた電気化学測定法を用いた精製酵素17。しかし、以来、 s. oneidensis氏-1 の現在の生産の結果、複数の多様なと変動プロセス18から、レート制限プロセスとして EET を識別できない単に 1 つ。EET と相まってプロトン輸送過程の KIE を観察する我々 は OM cを介して電子輸送によって微生物の現在の生産が制限されることを確認する必要があります – 電極に假。この目的のため最適 pH と KIE 測定前に温度条件を電子供与体として乳酸の高濃度を含む新鮮な培地と培養上清中のソリューションを置き換えこの交換は、2 つの役割を提供しています: (1) これに EET と比較して上流の代謝プロセスのレートを強化、(2) 作業電極 ( s. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムから発売清スイミング セルの省略インジウム スズ添加酸化物 (ITO) 電極)。提示の詳しいプロトコルを新しい実務を維持し、EET プロセスが、律速段階であることを確認します。
Protocol
1. s. oneidensis氏-1 ITO 電極 (図 1) 上の単分子膜バイオ フィルムの形成 注: 他の微生物の電気化学リアクターの汚染を防ぐためには、すべてのメディア、実装、および電気化学リアクターのコンポーネント殺菌を行う事前に。ときにすべてのプロシージャをクリーン ベンチで行うべきs. oneidensis氏 1 セルを使用し、電気化学リアクターを構築…
Representative Results
(彼女) と 0.4 V で潜在的なアプリケーションの 25 時間後単分子膜バイオ フィルムは ITO ガラス、走査型電子顕微鏡や共焦点顕微鏡4で確認された以前の作用電極に形成されました。単分子膜バイオ フィルムの形成の間にs. oneidensis氏 1 から現在の生産の代表的な時間コースを図 2に示します。現在の生産は現在の間隔で変更…
Discussion
我々 の全細胞の電気化学的分析タンパク質電気化学と比較していくつかの技術的な利点があります。蛋白質の浄化には、多段階の時間のかかる手続きが必要ですが、本全体セル手法で自己組織化バイオ フィルム形成細胞培養後 1 日は。OM cの安定した相互作用を達成するために – 假と電極、必要がありますのみ殺菌と電極表面のクリーニングOM cを定位しながら、電極上にアタッ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品の財政上支えられる補助金・特別推進研究の科学振興費助成番号 24000010、17 H 04969、日本社会からの JP17J02602、米国オフィスの海軍研究のグローバル (N62909-17-1-2038)。保は、日本学術振興会特別研究員、プログラムを通じて日本学術振興会での主要な大学院の学校 (メリット) をサポートします。
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
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Citer Cet Article
Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (134), e57584, doi:10.3791/57584 (2018).