A11-positiv β-amyloid oligomerer beredning och bedömning med hjälp av Dot Blotting analys

Summary

Det här protokollet beskriver hur att förbereda Aβ oligomerer från en syntetisk peptid i vitro och utvärdera relativa mängder av Aβ oligomerer av en prick blotting analys.

Abstract

Β-amyloid (Aβ) är en hydrofoba peptid med en inneboende tendens att själv montera i aggregat. Bland olika aggregat, Aβ oligomer är allmänt accepterat som den ledande nervgift i utvecklingen av Alzheimers sjukdom (AD) och anses vara den avgörande händelsen i patogenesen av AD. Därför Aβ oligomer hämmare kan förhindra neurodegeneration och har potential att utvecklas som sjukdomsmodifierande behandlingar av AD. Olika bildandet protokoll av Aβ oligomer kan dock leda till oligomerer med olika egenskaper. Dessutom finns det inte många metoder för att effektivt skärmen Aβ_1-42 oligomer-hämmare. En A11 antikropp kan reagera med en delmängd av giftiga Aβ_1-42 oligomer med anti parallell β-ark strukturer. I detta protokoll beskriver vi hur att förbereda en A11-positiv Aβ_1-42 oligomer-rika prov från en syntetisk Aβ_1-42 peptid i vitro och utvärdera relativa belopp för A11-positiv Aβ_1-42 oligomer i prover av en dot blotting analys med A11 och Aβ_1-42-specifika 6E10 antikroppar. Användning av detta protokoll, kan hämmare av A11-positiv Aβ_1-42 oligomer också undersökas från semikvantitativt experimentella resultat.

Introduction

Alzheimers sjukdom (AD) är en av de viktigaste neurodegenerativa sjukdomar som drabbar äldre människor världen över¹. Det är allmänt accepterat att onormala sammanläggning av β-amyloid (Aβ) kan vara den ledande patologiska faktorn av AD. Aβ-aggregat är huvudkomponenterna i senila plack, en av de biologiska markörerna i hjärnan hos AD-patienter. Dessutom producerar Aβ aggregat, inklusive oligomerer särskilt potent neurotoxicitet, som kan vara den neuronala dödsorsaken som AD fortskrider. Därför hämning av Aβ oligomer bildandet kan förebygga neurodegeneration och Aβ oligomer hämmare skulle kunna utvecklas som sjukdomsmodifierande behandlingar av AD. Många studier har använt en syntetisk Aβ-peptid för att bilda oligomerer i vitro, utforska morfologier och strukturer av konstgjorda Aβ oligomerer och undersöka hämmare av Aβ oligomer med in vitro- modeller^{2,3 , 4}. dock olika in vitro- bildandet protokoll av Aβ oligomer kan leda till oligomer med olika morfologiska kännetecken, som kan orsaka de ojämförliga resultat bland olika forskargrupper. Därför är ett standard bildandet protokoll för Aβ oligomer brådskande.

Tills nu, har inte många metoder rapporterats att direkt detektera Aβ oligomerer. Överföring elektronisk microscopy (TEM), icke-denatureringen gelelektrofores, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) och dot blotting analys kan användas för att undersöka de belopp och/eller morfologi av Aβ oligomer in vitro-^{5, 6}. exempel på Morfologi och struktur av Aβ oligomer kan observeras i TEM. Den relativa belopp och molekylär storlek av Aβ aggregeringar kunde mätas med icke-denatureringen gelelektrofores. ELISA kunde användas för att bestämma Aβ oligomer i serum, plasma och extrakt från hjärnvävnaden. Slutligen kunde dot blotting analys, en teknik som används för att upptäcka, analysera och identifiera proteiner, användas för att utvärdera den relativa koncentrationen av Aβ oligomer i olika prover med hjälp av oligomer-specifika och Aβ-specifika antikroppar. Dessutom erbjuder en prick blotting assay betydande tidsvinst, gelelektrofores och blotting förfarandena för geler inte krävs. Denna analys används därför normalt att skärmen potentiella Aβ oligomer inhibitorer. Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva en relativt enkla, tillförlitliga och reproducerbara metod för att förbereda en Aβ_1-42 oligomer-rika prov, att analysera belopp av Aβ_1-42 oligomer dot blotting analys och att skärmen Aβ oligomer -hämmare med semikvantitativ experimentella resultat.

Protocol

1. lösningen förberedelse Obs: Se Tabell av material för reagens källor. Bered en 5% bovint serumalbumin (BSA) genom att lägga till 5 g av BSA 100 mL dubbeldestillerat vatten. Blanda dem helt av vortexa dem. Förvara lösningen vid 4 ° C i upp till 1 månad. Bered en anti oligomer antikropp A11 (1:1, 000) genom att lägga till 10 µL av antikropp stamlösning till 10 mL av 5% BSA lösningen. Blanda dem helt av vortexa dem. Förvara lösningen vid 4 °…

Representative Results

För att undersöka huruvida en Aβ1-42 monomer kan bilda en Aβ1-42 oligomer efter beredning, användes TEM analys. Inga synliga aggregat observerades i Bovallstrand-upplöst Aβ1-42 monomer provet (figur 1A). Dessutom främst klotformiga aggregat med en diameter på runt 10-80 nm observerades i Aβ1-42 provet efter 48 h av skakningar, vilket tyder på att Aβ1-42 bildar oligomerer efter…

Discussion

I detta protokoll, har vi rapporterat en metod att förbereda prover som innehåller Aβ_1-42 oligomer och analysera mängder A11-positiv Aβ_1-42 oligomerer av en prick blotting analys. Även om våra metoder för beredning av Aβ_1-42 oligomer-rika prover är ganska enkla, tillförlitliga och reproducerbara, finns det fortfarande några punkter att märkas. För det första används Bovallstrand att upplösa den syntetiska Aβ_1-42 peptiden. En aggregerad Aβ_1-42 pepti…

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi