Genes candidatos en estudios de cohorte clínica con genotipificación multiplexado y espectrometría de masas
Summary
Identificación de variantes genéticas que contribuyen a enfermedades humanas complejas nos permite identificar nuevos mecanismos. Aquí, demostramos un enfoque genotyping multiplex para genes candidatos o análisis de la vía genética que maximiza la cobertura a bajo costo y es favorable a los estudios de cohorte.
Abstract
Enfermedades complejas a menudo se basa en múltiples variantes genéticas comunes que contribuyen a la susceptibilidad de la enfermedad. Aquí, describimos un enfoque de polimorfismo (SNP) de un solo nucleótido etiqueta rentable usando un análisis de genotipificación multiplexados con espectrometría de masas, para investigar las asociaciones vía gene en cohortes clínicas. Investigamos el locus de candidato de alergia de alimentos Interleukin13 (IL13) como ejemplo. Este método maximiza eficientemente la cobertura mediante el aprovechamiento compartido de ligamiento (LD) dentro de una región. SNPs seleccionados de LD se diseñó en un ensayo de multiplexado, que permite hasta 40 diferentes SNP a analizar al mismo tiempo, impulsar la rentabilidad. Reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar los loci de destino, seguidos por extensión de un solo nucleótido, y los amplicones se miden mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización-tiempo de espectrometría de masas flight(MALDI-TOF). La salida se analiza con el genotipo llamada software, utilizando las definiciones de control de calidad estricto y cortes, y genotipos de alta probabilidad se determina y de salida para análisis de datos.
Introduction
En las enfermedades humanas complejas, variantes genéticas que contribuyen a la susceptibilidad de la enfermedad y cuantificar estas variantes puede ser útil para la patogenesia de la comprensión, identificar grupos de pacientes de alto riesgo y equipos de respuesta de tratamiento. De hecho, la promesa de la medicina de precisión depende utilizando información genómica para identificar subgrupos de pacientes1. Por desgracia, dentro del espacio de Biología de la enfermedad compleja, donde los fenotipos de la enfermedad se basa en la considerable heterogeneidad genética, baja penetrancia y expresividad variable, cohorte tamaño requisitos para enfoques de genoma identificar la novela los candidatos suelen ser prohibitivamente grande2. Como alternativa, un enfoque del gen candidato objetivo comienza con una hipótesis a priori sobre genes/vías específicas en la etiología de la enfermedad3. Herramientas de análisis de camino se utilizan para investigar la fisiopatología de un loci de destino identificados, generando numerosas vías de candidato a ser explorado. Aquí demostramos un enfoque genotyping multiplexado que permite la investigación de decenas o cientos de SNP con un ensayo, adecuada a cohortes humano estudios4. Este enfoque es relativamente alto rendimiento, permitiendo a cientos de miles de muestras de ADN a ser genotipados para estudios de nuevos descubrimiento y la investigación de vías específicas. Los métodos aquí descritos son útiles para identificar los alelos de riesgo y sus asociaciones con rasgos clínicos de una manera relativamente rápida y barata. Esta plataforma ha sido muy ventajosa para screening y diagnóstico propósitos5,6y más recientemente, para infección microbiana7 y8de virus del papiloma humano.
Este protocolo se inicia con la selección de un conjunto de genes para la investigación, es decir., las regiones de destino, típicamente determinadas a través de búsqueda de literatura, o hipótesis a priori por su participación en el proceso de la enfermedad; o tal vez seleccionado para la replicación como las principales asociaciones de un estudio de asociación del genoma (AGA) del descubrimiento. Desde el gen, el investigador seleccionará una lista refinada de etiqueta SNPs. Es decir, el ligamiento (LD), o correlación entre las variantes en la región se utiliza para identificar a un representante ‘tag SNP’ para un grupo de SNPs en alta LD, conocido como un haplotipo. El LD alta de la región significa que los SNPs a menudo heredan juntos que el Genotipado de un SNP es suficiente para representar la variación de los SNPs en el haplotipo. Como alternativa, si después de una lista definitiva de SNPs de muchas regiones, por ejemplo., la replicación de un estudio GWA, este proceso puede ser innecesario. Para genotipificación multiplexado, un ensayo entonces debe ser diseñado alrededor de estos objetivos que los cebadores de amplificación son de masa diferentes a los de los cebadores de extensión y productos para producir interpretable espectros de masas. Estos parámetros son fácilmente implementados por una herramienta de diseño de ensayo de genotipado multiplexados. Los iniciadores adelante y atrás de este diseño se utilizará a los marcadores de interés y amplificar la secuencia que contiene el SNP. Los cebadores de extensión fije directamente proximal a la SNP y se añade una base única, masa modificado, ‘terminator’ que es complementaria al SNP. La base de terminator evita que más extensión de la DNA. La masa-modificación de la base permite fragmentos diferentes de una única base para ser detectado por espectrometría de masas. La placa que contiene la química de genotipado se aplica a un chip para la medición en una plataforma de espectrometría de masas. Después de aplicar los controles de calidad adecuados a las llamadas de genotipado crudo detectadas por el sistema, los datos pueden exportados y utilizados para el análisis estadístico para probar la asociación con fenotipos de la enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos que el método de multiplexado genotipado mediante espectrometría de masas. Se obtuvieron los resultados representativos mediante PCR con MALDI-TOF espectrometría de masa4 con química de ensayo enumerados en la Tabla de materiales13. Con esta plataforma, hemos generado un total de 11.295 genotipos en 1.255 personas para 9 SNPs dentro de 40 h en el laboratorio.
Nos ilustran la utilidad de la técnica en conte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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