Ultra basse génome d’entrée séquençage bibliothèque préparation à partir d’un seul spécimen Tardigrade

Résumé

Contamination pendant le séquençage génomique des organismes microscopiques demeure un grand problème. Ici, nous montrons une méthode pour séquencer le génome d’un tardigrade un seul spécimen avec aussi peu que 50 pg d’ADN génomique sans amplification du génome entier pour minimiser le risque de contamination.

Résumé

Tardigrades sont des animaux microscopiques qui entrent dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose face à la dessiccation et peuvent revenir à leur état d’origine lorsque l’eau est fournie. Le séquençage génomique des animaux microscopiques tels que la contamination bactérienne de risques tardigrades qui conduit parfois à des interprétations erronées, par exemple, au sujet de l’étendue du transfert horizontal de gènes chez ces animaux. Ici, nous fournissons une méthode d’entrée ultra basse pour séquencer le génome du tardigrade, Hypsibius dujardini, un seul spécimen. En employant l’exclusion de lavage et contaminant rigoureuse avec une extraction efficace de 50 ~ 200 pg d’ADN génomique d’un seul individu, nous avons construit une bibliothèque séquencée avec un instrument de séquençage de l’ADN. Ces bibliothèques ont été hautement reproductible et impartiale, et une analyse informatique des lectures séquencés avec autres génomes H. dujardini a montré une quantité minime de contamination. Cette méthode peut être appliquée à des tardigrades impossibles qui ne pourraient pas être séquencés à l’aide des méthodes précédentes.

Introduction

Tardigrades sont des animaux microscopiques peuvent entrer dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose, face à la dessiccation. Ils récupèrent de l’absorption de l’eau^1,2. Dans l’état d’ametábolos, les tardigrades sont capables de tolérer des divers environnements extrêmes, incluent des températures extrêmes pressions et^{3 4,5}, une dose élevée de lumière ultraviolette⁶, rayons x et rayons gamma ^{7 , 8}et⁹de l’espace cosmique....

Protocole

1. préparation

1. Préparer un gel d’agarose de 2 % avec de l’eau distillée (DW) comme solvant dans une boîte de Petri en plastique de 90 mm et 10 mL d’un cocktail avec DW 1 % pénicilline/streptomycine. Le gel peut être conservé pendant 2 à 3 semaines dans un incubateur à 18 ° C.
   NOTE : Éviter tout stockage du gel inférieures à 10 ° C, pour la basse température va diminuer le gel d’agarose, résultant dans un espace minuscule entre le gel et le mur plat de culture dans laquelle les tardigrades peuvent être pris au piège.

2. préparation des échantillons et Exclusion de Contaminant

1. Recueillir un tardigrade unique, plac....

Résultats

Exclusion de contaminant :

Ce protocole implique un lavage complet de la Tardigrada et une stérilisation avec un traitement d’antibiotiques pour minimiser la contamination. Elle comporte également un processus de vérification visuel pour s’assurer de la conformité de ces processus. Une image microscopique faite lors de la validation (étape 2.4 du protocole) est illustrée à la Figure 2

Discussion

La contamination bactérienne constitue une menace pour le séquençage génomique des organismes microscopiques. Alors que des études antérieures sur le séquençage du génome tardigrade ont filtré de contamination en utilisant une vaste informatique méthodes^12,20, ils ont séquencé le génome d’un seul individu pour minimiser les risques de contaminations. Comme un tardigrade individuel contient environ 50-200 pg d’ADN génomique¹⁶ et soit revêtu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope SZ61	OLYMPUS
BactoAgar	Difco Laboratories	214010
Pénicilline Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco by life technologies	15140-148
VHX-5000 System	Keyence
0.2mL Tube de revêtement en silicone	Bio Medical Science	BC-bmb20200
Quick-DNA Kit de micropréparation	ZYMO Research	D3021	L’utilisation de ce kit est absolument critique ; voir étape 3.1
Granulomètre à microtubes de 1,5 mL	bio-one	616-201	Voir 4.1.1
Microcentrifugeuse réfrigérée à haute vitesse	TOMY	MX-307
Covaris M220	Covaris Inc.
Kit ThruPLEX DNA-Seq	Rubicon Genomics	CAT. NO. R400406	L’utilisation de ce kit est absolument critique ; voir étape 4.2
Thermocycleur	Bioer Technology	TC-96GHbC
Réactif AMPure XP	BECKMAN COULTER Life Science	A63881
Éthanol	Wako	054-027335
Tampon EB	QIAGEN	19086
2200 TapeStation	Agilent	G2965AA
D1000 Réactifs	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Qubit dsDNA BR Tampon/Réactif	ThermoFisher Scientific	Q32850
Cubee Mini-Centrifuge	RecenttecGenereach	R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3	Illumina Inc.	MS-102-3003
Séquenceur MiSeq	Illumina Inc.	SY-410-1003

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