Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi
Summary
Burada, embriyonik tavuk organları büyümeye Protokolü kültür bir organotypic mevcut tüp bebek. Bu yöntemi kullanarak, embriyonik tavuk doku gelişimi, kültür ortamı üzerinde kontrol yüksek derecede korunarak okudu.
Abstract
Embriyonik tavuk genellikle omurgalı geliştirme için bir güvenilir model organizma kullanılır. Onun erişilebilirlik ve kısa kuluçka dönemi yapar deneme için ideal. Şu anda, tavuk embriyo gelişimsel bu yollar çalışmanın inhibitörleri ve uyuşturucu yerelleştirilmiş sitelerde ve çeşitli yöntemler kullanarak düşük konsantrasyonlarda uygulayarak yapılır. Vitro doku kültürü, konak organizmanın aynı anda birçok fiziksel sınırlamalar mevcut embriyolar için duyarlılık gibi bütün embriyo ile çalışırken atlayarak sırasında ayrılmış dokuların çalışma sağlayan bir tekniktir ölümcül kimyasal yüksek dozda. Burada, kültür gelişimsel süreçleri ötesinde şu anda kurulan yöntemleri incelenmesi için yeni fırsatlar sunan embriyonik tavuk yarım baş vitro, kültür için protokol bir organotypic mevcut.
Introduction
Embriyonik tavuk (Gallus gallus) biyoloji alanında yaygın olarak kullanılan bir mükemmel model organizmadır. Kuluçka süresinin yaklaşık 21 gün olduğunu ve birçok yumurta aynı anda, hızlı ve verimli deneme yapma inkübe. Belki de en önemlisi, embriyo da kolaylıkla, yoğun çalışma temel gelişimsel süreçleri ve genler ve proteinler bu işlemler sürücü etkinleştirme yönetilebilir.
Embriyonik tavuk göz üzerinden farklı dokuların birçok diğer vücut sistemleri için benzer bir dizi etkileşim gelişir karmaşık bir organdır. Bu yöntem, gelişmiş gelişim aşamasında özellikle bu dokuların gelişimi çalışma sağlar. Örneğin, çok katmanlı retina sinir sisteminin gelişimi eğitim görenler için özel ilgi olabilir. Kornea, vitreal vücut, objektif, sklera ve göz kapakları gibi diğer göz dokuların çalışma alternatif yöntemleri araştırmacılar yararı vardır. Tavuk embriyonik göz de düz kemikleri, Intramembranous kemik indüksiyon ve ossifikasyon omurgalılar1çalışma için bir model olarak kullanılan scleral kemikçiklerdeki bir dizi içerir.
Şu anda, embriyonik geliştirme eğitim için kullanılan bir yöntem vardır. İnhibitör antikorlar veya diğer inhibitör molekülleri2,3, microinjections cerrahi olarak inhibitörü4‘ te batırılmış lastikteki implante ve adım5 tümleyici genler için kullanılabilir tüm yöntem vardır ya da bir embriyo ilgi proteinler. Benzer yöntemleri upregulate proteinler için kullanılır. Bu yöntemleri sınırlamaları değildir. Örneğin, kimyasallar embriyonik gelişim alter için kullanıldığında, embriyo üzerinde ölümcül etkileri değerlendirilecek gerekir ve bu uygulamanın, Beka sağlamak için düşük dozda yerelleştirilmiş sitelere yukarıda belirtilen yöntemlerden kısıtlar embriyo.
Vitro doku kültürü organizmalar geniş bir geliştirme eğitim için kullanılan ve bazı yukarıda belirtilen sınırlamaları bypass için kullanılabilir. Örneğin, femora6, tüy tomurcukları7,8ve bacaklarda9 tavuk tüm doku kültürü yöntemleri, fare10 ve kökleri testis ve köklerini bitkiler11olarak kullanarak incelenmiştir. Bu yöntemler bilim adamları yüksek derecede sıcaklık dalgalanma ve besin durumu değiştirme yeteneği gibi doku geliştirme üzerinde kontrol vermek. Bütün embriyo dokudan yalıtım da böylece düzenleme çalışmaları daha yüksek konsantrasyonlarda küresel ölçekte etkinleştirme kimyasalların ölümcül etkileri çok daha az duyarlı kolaylaştırır. Vitro kültürü bir diğer önemli avantajı doku’nın hücresel ortamı korunması olduğunu; dokuların düzenleme farklı doku türlerine9arasındaki etkileşimler çalışma edinerek nispeten değişmeden kalır. Böylece, deneysel açılır kapılar için ek kültür vitro değil vivo içinde veya ovo içinde modelleri mevcuttur yaklaşıyor.
Şu anda, kimyasallar kullanarak embriyonik tavuk göz gelişimi eğitimi özellikle meydan okuyor. Bir dizi extraembryonic membranlar lastikteki veya kimyasal uygulamak üzere embriyo, kapak; o zaten zor bir yöntem daha da zorlaştıran, büyüdükçe embriyo Ayrıca yumurta içinde çok aktif. Bu iletişim kuralı göz ve aynı zamanda göz içinde gelişim süreçlerini incelemek için yeni fırsatlar sağlarken bu engelleri ortadan kaldırarak onun çevre dokular kolay erişim sağlar. Bu iletişim kuralı embriyonik göz içinde scleral kemikçiklerdeki indüksiyon çalışmaya kurulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı bir tavuk gözünden embriyonik gün 8 (HH34) büyüme elde etmek için kurulan doku kültürü teknikleri kullanır vitro 4 gün için. Bu kılavuz kültür Yöntem aslında Trowell15tarafından tanımlanmıştır. Biz en iyi duruma getirilmiş bir protokol kullanan embriyonik tavuk göz15ayrı doku katmanları arasında endüktif sinyalleri çalışma için kılavuz ile yarı geçirgen bir zar olan Pinto ve Hall’ın 1991 çalışma<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar protokol gelişiminde ön çalışmaları için Gregory Haller (Mount Saint Vincent Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca onun teknik uzmanlık ve filme ve üretim el yazması ses/görüntü bölümü ile ilgili yardım için Nicholas Jones (Mount Saint Vincent Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Daniel Andrews MSVU ve Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) yolu ile bir lisans öğrenci Araştırma Ödülü fon tarafından desteklenmiştir. Tamara A. Franz-Odendaal bir NSERC bulma Grant tarafından desteklenir.
Materials
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
