Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte
Summary
Nous décrivons ici l’isolement de cellules gliales-entérique de la sous-muqueuse intestinale à l’aide des incubations EDTA séquentielles pour chélater les cations divalents, puis incubation dans une solution de récupération non enzymatique cellulaire. Placage de la suspension de cellules qui en résultent sur le poly-D-lysine et de la laminine se traduit par une culture fortement enrichie des cellules gliales sous-muqueux analyse fonctionnelle.
Abstract
Le système nerveux entérique (ENS) est constitué de neurones et les cellules gliales entériques (EGCs) qui résident dans la paroi musculaire lisse, la sous-muqueuse et la lamina propria. EGCs jouent un rôle important dans l’homéostasie intestinale grâce à la publication de divers facteurs trophiques et contribuent à l’intégrité de la barrière épithéliale. La plupart des études des cultures primaires de gliales entériques utilisent des cellules isolées de plexus myentérique après dissociation enzymatique. Ici, on décrit une méthode non enzymatique d’isoler et de la culture de EGCs de la sous-muqueuse intestinale et de la lamina propria. Après la suppression manuelle de la couche musculaire longitudinale, EGCs furent libérés de la lamina propria et de la sous-muqueuse en utilisant des incubations tampon HEPES EDTA séquentielles, suivies d’une incubation dans une solution de récupération disponibles dans le commerce non enzymatique cellulaire. Les incubations d’EDTA ne suffisaient pas à dépouiller la majeure partie de la muqueuse épithéliale de la lamina propria, permettant à la solution de récupération des cellules afin de libérer les sous-muqueuse EGCs. Toute résiduelle lamina propria et le muscle lisse a été écartée avec la glie myentériques. EGCs ont été facilement identifiés par leur capacité à exprimer la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP). Seulement environ 50 % de la suspension cellulaire contenaient GFAP + cellules après des incubations de tissu et avant la culture sur le substrat de poly-D-lysine/laminine. Toutefois, après 3 jours de culture de cellules de facteurs neurotrophiques cellule gliale (GDNF)-contenant des milieux de culture, la population de cellules adhérant aux plaques recouvertes de substrat composé de > 95 % glie entérique. Nous avons créé une lignée de souris hybride en croisant une souris hGFAP-Cre à la ligne de journaliste ROSA-tdTomato pour suivre le pourcentage de cellules GFAP + à l’aide de la fluorescence des cellules endogènes. Ainsi, non-myentérique glie entérique peut être isolé par des méthodes non enzymatiques et cultivée pendant au moins 5 jours.
Introduction
Intérêt pour la fonction des cellules gliales entériques (EGCs) a cessé d’augmenter en raison de leur rôle reconnu dans le tube digestif l’intégrité et l’homéostasie du1,2. En outre, EGCs varient selon leur emplacement le long du tractus GI3,4. EGCs libérer différents facteurs trophiques, y compris les facteurs neurotrophiques cellule gliale (GDNF), contribuent à gut motilité1,5 et répondre aux sous-produits microbienne6,7. Des études ont indiqué que la population de l’EGC est hétérogène et que leur fonction varie selon qu’ils sont sous-muqueux ou résident dans le plexus myentérique1,7. Par exemple, EGCs dans la sous-muqueuse contribuent à des jonctions serrées,8. Differential expression GFAP et phosphorylation de EGCs ont été liés à la maladie de Parkinson, ce qui suggère leur lien possible avec le phénotype de l’intestin de ce trouble9. Récemment, on a fait observer que la perte de la protéine nucléaire de menin en cultures isolées de EGCs de la sous-muqueuse intestinale proximale est suffisante pour induire l’expression de l’hormone gastrine10. En conséquence, il a été proposé que EGCs pourraient être à l’origine de gastrinomas duodénal, un type de tumeurs neuro-endocrines10. Collectivement, ces exemples mettent en évidence l’importance d’étudier le comportement et la fonction de EGCs isolés dans les troubles neuropathiques et cancer11.
Le défi dans le domaine reste comment isoler et étudier un ou des deux EGC populations in vitro. Lignage trace des expériences ont démontré que EGCs dans la sous-muqueuse et de la lamina propria proviennent de cellules progénitrices du de plexus myentérique7. Bien qu’il existe plusieurs protocoles d’isolement publiées disponibles pour générer des cultures de myentérique EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, aucun vise particulièrement l’isolement de la population de EGC sous-muqueuse/lamina propria. Les protocoles existants pour l’isolement de l’EGC spécifiquement utilisent une combinaison de la séparation mécanique ou la microdissection du muscle lisse combiné avec dissociation enzymatique, finit par jeter la couche de cellules muqueuses.
L’objectif de ce manuscrit est pour montrer les étapes pour isoler non enzymatique EGCs primaires de la lamina propria pour des études in vitro . Puisqu’il n’y a aucun marqueur qui distinguent spécifiquement EGCs myentérique de ceux dans la sous-muqueuse, la séparation spatiale de la muqueuse épithéliale du muscle lisse a été exploitée pour isoler EGCs sous-muqueux. De plus, en combinant la chélation EDTA avec dissociation non enzymatique, EGCs ont été isolés de la sous-muqueuse contraste avec le muscle lisse, qui a été mis au rebut avec les EGCs inter-myentérique associé. Nouvelle séparation de la sous-muqueuse et de la lamina propria EGCs se sont produits en cultivant des cellules gliales substrats cellulaires de l’environnement, par exemple, poly-D-lysine et laminine.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs jouent un rôle important dans l’homéostasie intestinale, et il est essentiel d’isoler et d’étudier in vitro. Dans ce protocole, une méthode simple pour isoler EGCs de la lamina propria de l’intestin de souris adultes a été introduite pour étudier la fonction gliale entérique.
Enlever le mésentère adhérente et LMMP avec un coton-tige prélève un échantillon de la glie inter-myentérique résidant entre les muscles longitudinaux et circulaires, augmente l’acc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner l’appui de DK045729 R37 (à JLM), AR060837 R01 (à HX) et l’Université du Michigan Gastrointestinal Research Center moléculaire Core P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
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