वयस्क माउस के श्लेष्मा और लेमिना Propria से प्रवेश Glial कोशिकाओं का अलगाव
Summary
यहां, हम आंतों से glial कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन-श्लेष्मा EDTA chelate divalent cations और फिर गैर में मशीन-एंजाइमी सेल वसूली समाधान के लिए अनुक्रमिक-म्यूकोसा का उपयोग कर । कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सबम्यूकोसल glial कोशिकाओं की एक अत्यधिक समृद्ध संस्कृति में पाली-डी-lysine और laminin परिणाम पर परिणामी सेल निलंबन चढ़ाना ।
Abstract
दर्जी तंत्रिका तंत्र (िनों) न्यूरॉन्स और प्रवेश glial कोशिकाओं (EGCs) है कि चिकनी मांसपेशियों की दीवार के भीतर रहते हैं, उपश्लेषक और लेमिना propria. EGCs विभिंन पौष्टिकता कारकों की रिहाई के माध्यम से आंत homeostasis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और उपकला बाधा की अखंडता के लिए योगदान करते हैं । प्राथमिक दर्जी glial संस्कृतियों का सबसे अध्ययन एंजाइमी पृथक्करण के बाद myenteric जाल से पृथक कोशिकाओं का उपयोग करें । यहाँ, अलग करने के लिए एक गैर-एंजाइमी विधि और आंत्र उपम्यूकोसा और लेमिना propria से EGCs संस्कृति का वर्णन किया गया है । अनुदैर्ध्य मांसपेशी परत के मैनुअल हटाने के बाद, EGCs व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गैर HEPES सेल वसूली समाधान में मशीन द्वारा पीछा लेमिना propria और अनुक्रमिक EDTA बफर एंजाइमी की गर्मी का उपयोग कर म्यूकोसा से मुक्त थे । EDTA गर्मी लेमिना propria से उपकला म्यूकोसा के सबसे पट्टी करने के लिए पर्याप्त थे, सबम्यूकोसल EGCs को मुक्त करने के लिए सेल वसूली समाधान की अनुमति । किसी भी अवशिष्ट लेमिना propria और चिकनी मांसपेशी myenteric glia के साथ छोड़ दिया गया था । EGCs आसानी से glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) व्यक्त करने की क्षमता से पहचाना गया । केवल सेल निलंबन के बारे में ५०% निहित GFAP + कोशिकाओं ऊतक की गर्मी को पूरा करने के बाद और पाली-डी-lysine/laminin सब्सट्रेट पर चढ़ाना करने से पहले. हालांकि, संवर्धन के 3 दिनों के बाद glial सेल में कोशिकाओं-व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (GDNF)-संस्कृति मीडिया युक्त, सेल सब्सट्रेट लेपित प्लेटों के लिए पालन की आबादी में शामिल > 95% प्रवेश glia । हम रोजा-tdTomato रिपोर्टर लाइन के लिए एक hGFAP-Cre माउस प्रजनन द्वारा एक संकर माउस लाइन बनाया GFAP + अंतर्जात सेल प्रतिदीप्ति का उपयोग कर कोशिकाओं का प्रतिशत ट्रैक । इस प्रकार, गैर-myenteric एंट्रेंस glia को गैर-एंजाइमी तरीकों से अलग किया जा सकता है और कम से 5 दिनों के लिए कल्चरल कर सकते हैं ।
Introduction
प्रवेश glial कोशिकाओं (EGCs) के समारोह में रुचि तेजी से आंत अखंडता और homeostasis1,2में उनकी मांयता प्राप्त भूमिकाओं के कारण बढ़ गया है । इसके अलावा, EGCs सैनिक पथ3,4की लंबाई के साथ अपने स्थान के अनुसार बदलती हैं । EGCs glial कोशिका व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (GDNF) सहित विभिन्न पौष्टिकता कारकों रिहाई, आंत गतिशीलता1,5 में योगदान और माइक्रोबियल शोधकार्य6,7का जवाब । अध्ययनों से संकेत दिया है कि EGC जनसंख्या विषम है और है कि उनके समारोह कि वे सबम्यूकोसल रहे है या myenteric जाल1,7के भीतर रहते है पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, उपम्यूकोसा के भीतर EGCs तंग जंक्शनों में योगदान8। अंतर GFAP अभिव्यक्ति और EGCs में फास्फारिलीकरण पार्किंसंस रोग से जोड़ा गया है, इस विकार के आंत phenotype के लिए उनके संभव कड़ी सुझाव9। हाल ही में, यह देखा गया कि समीपस्थ आंत्र उपश्लेष्मा से EGCs की पृथक संस्कृतियों में परमाणु प्रोटीन menin की हानि हार्मोन गैस्ट्रीन10की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था । नतीजतन, यह प्रस्ताव किया गया था कि EGCs ग्रहणी gastrinomas, neuroendocrine ट्यूमर का एक प्रकार का मूल हो सकता है10। सामूहिक रूप से, इन उदाहरणों व्यवहार और neuropathic विकारों और11कैंसर में अलग EGCs के समारोह के अध्ययन की प्रासंगिकता को रेखांकित ।
क्षेत्र में चुनौती बनी रहती है कि कैसे अलग और अध्ययन या तो या दोनों EGC इन विट्रो मेंआबादी । वंश ट्रेस प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि EGCs में उपम्यूकोसा और लेमिना propria में जनक कोशिकाओं से उत्पन्न myenteric जाल7. यद्यपि वहां कई प्रकाशित अलगाव प्रोटोकॉल myenteric EGCs12,13,14,15,16,17की संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए उपलब्ध हैं, 18,19, कोई भी विशेष रूप से सबम्यूकोसल/लेमिना propria EGC जनसंख्या का अलगाव लक्ष्य । EGC अलगाव के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल विशेष रूप से यांत्रिक जुदाई या चिकनी एंजाइमी पृथक्करण के साथ संयुक्त मांसपेशी के microdissection का एक संयोजन का उपयोग करें, अंततः श्लैष्मिक कोशिका परत खारिज ।
इस पांडुलिपि के लक्ष्य को गैर enzymatically अलग प्राथमिक EGCs लेमिना propria इन विट्रो में अध्ययन के लिए कदम प्रदर्शित करने के लिए है । के बाद से वहां कोई मार्करों है कि विशेष रूप से myenteric EGCs के उपम्यूकोसा में भेद कर रहे हैं, चिकनी मांसपेशी से उपकला म्यूकोसा के स्थानिक जुदाई सबम्यूकोसल EGCs को अलग करने के लिए शोषण किया गया था । इसके अलावा, गैर-एंजाइमी पृथक्करण के साथ EDTA केलेशनथेरेपी के संयोजन के द्वारा, EGCs चिकनी मांसपेशी के विपरीत श्लेष्मा से अलग किया गया था, जो संबद्ध अंतर-myenteric EGCs के साथ छोड़ दिया गया था । इसके अलावा उपम्यूकोसा और लेमिना propria EGCs की जुदाई glial सेल के अनुकूल सब्सट्रेट, जैसे, पाली-डी-lysine और laminin पर कोशिकाओं संवर्धन द्वारा हुई ।
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs आंत homeostasis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और यह अलग और उंहें इन विट्रो मेंअध्ययन करने के लिए आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल में, वयस्क माउस आंत के लेमिना propria से EGCs अलग करने के लिए एक सरल तरीका में प्रवेशात?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक को R37 DK045729 (JLM), R01 AR060837 (सेमी) और मिशिगन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल अनुसंधान केंद्र आणविक कोर P30 DK034933 के विश्वविद्यालय से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
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