Selvstændigt elektrokemiske Set-up til at berige Anode-respiring bakterier på stedet
Summary
On-site mikrobielle berigelse eller i situ dyrkningsmetoder kan lette isolering af vanskelige at kultur mikrobielle taxa, især fra lav-biomasse eller geochemically ekstreme miljøer. Her, beskriver vi en elektrokemisk set-up uden at bruge en ekstern strømkilde til at berige mikrobielle stammer, der er i stand til af ekstracellulære elektron transport (EET).
Abstract
Anaerob respiration kombineret med elektron transport til uopløselige mineraler (benævnt ekstracellulære elektron transport [EET]) menes at være kritisk for mikrobiel energiproduktion og vedholdenhed i mange undergrunden miljøer, især dem mangler opløselige terminal elektronacceptorer. Mens EET-habil mikrober blevet med held isoleret fra forskellige miljøer, mangfoldigheden af bakterier i stand til at EET er stadig dårligt forstået, især i vanskelige at prøve, lav energi eller ekstreme miljøer, såsom mange undergrunden økosystemer. Her, beskriver vi en on-site elektrokemiske system for at berige EET-habil bakterier bruger en anode som en respiratorisk terminal elektron acceptor. Denne anoden er tilsluttet en katode i stand til at katalysere abiotiske ilt reduktion. Sammenligne denne tilgang med electrocultivation metoder, der bruger en potentiostat for poising potentielle elektrode, kræver to-elektrode system ikke en ekstern strømkilde. Vi præsenterer et eksempel på vores egen berigelse udnyttes i en basisk Dam på Cedars, en jordbaseret serpentinization site i det nordlige Californien. Forudgående forsøg på at dyrke mineral reduktion bakterierne var mislykket, hvilket er sandsynligt på grund af lav-biomasse karakter af dette websted og/eller lav relativ overflod af metal at reducere mikrober. Forud for gennemførelsen af vores to-elektrode berigelse, målte vi koncentration af opløst ilt lodret profil. Dette tillod os at placere carbon følt anode og platinum-galvaniseret carbon følte katode på dybder, som vil støtte de anaerobe og aerobe processer, henholdsvis. Efter stedets inkubation, vi yderligere beriget anodisk elektroden i laboratoriet og bekræftet en særskilt mikrobielle samfund i forhold til overflade-attached eller biofilm Fællesskaber normalt observeret på Cedars. Denne berigelse efterfølgende førte til isolering af de første electrogenic mikrobe fra Cedars. Denne metode til on-site mikrobielle berigelse har potentiale til at øge isoleringen af EET-habil bakterier fra lav biomasse eller vanskeligt at prøve levesteder.
Introduction
Flere mineral-reducerende mikrober har vist sig at udnytte fast-fase mineraler som terminal elektronacceptorer, af ekstracellulære elektron transport (EET) processer, at adfærd elektroner til ydersiden af cellen via redox enzymer1. EET er afgørende, ikke kun for mikrobe-mineralske processer, men også anvendt energi og miljøteknologi, mikrobiel brændselsceller2, elektrode syntese3og bioremediering4. Nye EET-habil bakterier er meget efterspurgte, og er blevet grundigt undersøgt fra en grundlæggende eller anvendt perspektiv5. Men, vi kun har begrænset indblik i den økologiske eller biogeokemiske betydningen af disse bakterier. Fleste af EET-habil mikrober er isoleret efter berigelse fra aqua, sediment eller anaerob kogere ved hjælp af solid elektronacceptorer MnO2, Fe2O3 eller klar elektroder i laboratoriet6, 7 , 8. dog disse metoder ofte producerer lignende konsortier og potentielt savner mere følsomme taxa, der kan dominere lavenergi eller lav biomasse systemer, påvirke disse mikrober evne til at tilpasse sig til lab eller axenic kultur miljø9 . Normalt til miljøer med lav biomasse, er store mængder vand fra et websted filtreret for at koncentrere bakterieceller. Men EET-habil bakterier udviser ofte en anaerob stofskifte og derfor ilt eksponering kan yderligere hæmme eller forhindre deres dyrkning. Alternative on-site metoder at koncentrere celler uden at udsætte dem for ilt kunne lette isolering af EET-habil bakterier. Her rapporterer vi opsætningsoplysninger for en on-site elektrokemiske teknik til at berige EET-habil mikrobe over en lang periode uden behov for en ekstern strømkilde.
Ved hjælp af vores electrocultivation eksperimenter fra et stærkt alkalisk forår i det nordlige Californien, Cedars10, beskriver vi denne on-site elektrokemiske teknik. Geokemi fjedre på The Cedars er påvirket af serpentinization i den undergrund. Fjedrene er meget reduktionistisk, med ilt koncentrationer under påvisningsgrænsen under luft vand interface fremhæve potentialet for mikrobiel energiproduktion via EET i denne funktionelt iltfrit miljø11. Der er imidlertid ingen beviser til støtte for EET-habil mikrober fra Cedars (i enten 16S rRNA eller Metagenomic analyse). Selv om dette miljø er blevet karakteriseret som elektron acceptor begrænset, mulighederne for ved hjælp af uopløselige mineraler som terminal elektronacceptorer, herunder mineraler som jern blottelse mineraler, der skyldes serpentinization (dvs., magnetit), har ikke været grundigt undersøgte12. Vi, derfor indsat vores elektrokemiske system på campingplads Spring, en høj pH foråret på Cedars, at berige for EET-habil mikrober (figur1)13.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den beskrevne undersøgelse viser vi berigelsen af en mikrobiel konsortium, forbundet med i situ nuværende produktion. De observerede mønstre i nuværende støtte mikrobielle aktivitet i dette system over korte og lange tid skalaer. Den kritiske trin til at opbygge en funktionel to-elektrode (brændselscelle type) system at identificere og udnytte en placering med en stabil vand-niveau og iltkoncentrationen i miljøet. Katoden er udsat for ilt i luft vand interface, mens anoden er holdt under anaerobe beting…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende Roger Raiche og David McCrory for giver os adgang til Cedars og høring på steder for langsigtet inkubation. Vi takker også Cedars felt besætning i løbet af sæsonen 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam og Matthew Schechter. Yderligere Shino Suzuki og Gijs Kuenen for indsigtsfulde forskning og dyrkning støtte. Dette arbejde blev finansieret gennem en licensbetaling for unge videnskabsfolk A og B fra Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP’ER) KAKENHI Grant nummer 17H 04969 og 26810085, henholdsvis, og Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (17gm6010002h0002). Amerikanske støtte, som den os Office of Global Naval Research (N62909-17-1-2038) og Center for mørk energi biosfæren undersøgelser (C-DEBI) (OCE0939564) og NASA Astrobiology Institute – liv Underground (NAI-LU) (NNA13AA92A). En del af dette arbejde blev udført som del af en Japan samfundet for fremme Sciences: kortsigtede postdoc stipendium for Annette Rowe (PE15019) på University of Tokyo i laboratoriet af Kazuhito Hashimoto.
Materials
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).
- Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis – revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).
- Lovley, D. R., Coates, J. D. Bioremediation of metal contamination. Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).
- Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200. Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).
- Rowe, A. R., et al. In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring. Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).
- Suzuki, S., et al. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).
- Suzuki, S., et al. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communications. 5, 3900 (2014).
- McCollom, T. M., et al. Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine. Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).
- Morrill, P. L., et al. Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars. Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. . Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells. , 207-222 (2012).
- Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier. Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).
