Autoportant montage électrochimique pour enrichir les bactéries Anode-respirants sur place

Summary

Sur le site microbienne enrichissement ou in situ des techniques culturales peuvent faciliter l’isolement de difficile-à-culture microbiennes taxons, surtout des milieux de faible biomasse ou géochimique extrême. Nous décrivons ici un montage électrochimique sans utiliser de source d’alimentation externe pour enrichir des souches microbiennes capables de transport d’électrons extracellulaire (EET).

Abstract

Respiration anaérobie couplée avec le transport des électrons à des minéraux insolubles (dénommé extracellulaire transport d’électrons [EET]) est considérée comme critique pour la production d’énergie microbienne et la persistance dans de nombreux environnements souterrains, en particulier ceux manque d’accepteurs d’électrons terminal soluble. Alors que les microbes EET compatibles ont été avec succès isolés provenant de divers milieux, la diversité des bactéries capables de EET est encore mal compris, surtout en difficile à l’échantillon, basse énergie ou des environnements extrêmes, comme bon nombre de sous-sol écosystèmes. Nous décrivons ici un système électrochimique sur place afin d’enrichir les bactéries EET-capable, en utilisant une anode comme accepteur terminal d’électron respiratoire. Cette anode est reliée à une cathode capable de catalyser la réduction de l’oxygène abiotiques. En comparant cette approche avec des méthodes d’electrocultivation qui utilisent un potentiostat pour car le potentiel de l’électrode, le système de deux électrodes ne nécessite pas de source d’alimentation externe. Nous présentons un exemple de notre enrichissement sur le site utilisé dans un étang alcalin aux Cèdres, un site de serpentinisation terrestres dans le nord de la Californie. Tentatives préalables de cultiver les bactéries réductrices minéraux ont échoué, ce qui est probablement dû à la nature de faible biomasse de ce site et/ou l’abondance relative faible de métal réduisant les microbes. Avant d’implémenter notre enrichissement de deux électrodes, nous avons mesuré le profil vertical de la concentration d’oxygène dissous. Ceci nous a permis de placer le carbone ressenti anode et plaqué de platine carbone estimaient processus cathodiques à des profondeurs qui appuieraient aérobie et anaérobie, respectivement. Après l’incubation sur place, nous avons enrichi l’électrode anodique en laboratoire et a confirmé une communauté microbienne distincte par rapport à la surface-jointe ou communautés de biofilm normalement observées aux Cèdres. Cet enrichissement a par la suite conduit à l’isolement du premier microbe électrogénique de cèdres. Cette méthode d’enrichissement microbienne sur place a le potentiel d’améliorer considérablement l’isolement de bactéries EET capable de biomasse faible ou difficile aux habitats de l’échantillon.

Introduction

Plusieurs microbes réduction minérale ont démontré d’utiliser les minéraux en phase solide comme accepteur terminal d’électron, par des processus de transport des électrons extracellulaire (EET) qui effectuent des électrons à l’extérieur de la cellule par l’intermédiaire d’enzymes redox¹. EET est essentielle, non seulement pour le microbe-minéral mais aussi l’énergie appliquée technologies et procédés environnementaux, tels que les piles à combustible microbiennes², électrode synthèse³et⁴de la biorestauration. Nouvelles bactéries EET compatibles sont très recherchés et ont été largement étudiées d’un point de vue fondamentale ou appliquée⁵. Cependant, nous avons seulement limité aperçu de l’importance écologique ou biogéochimique de ces bactéries. La plupart des microbes EET compatibles ont été isolée après enrichissement d’aqua, sédiments ou des digesteurs anaérobies à l’aide des accepteurs d’électrons solides tels que MnO₂, Fe₂O₃ ou électrodes prêtes en laboratoire^{6, 7 , 8}. Toutefois, ces méthodes produisent souvent des consortiums similaires et potentiellement rater des taxons plus sensibles qui peuvent dominer à faible consommation d’énergie ou de systèmes de faible biomasse, polarisation de la capacité de ces microbes à s’adapter à la lab ou culture axénique environnement⁹ . Habituellement pour les environnements de faible biomasse, les grandes quantités d’eau provenant d’un site sont filtrées pour concentrer les cellules bactériennes. Cependant, EET-capable bactéries présentent souvent des métabolismes anaérobies et donc exposition oxygène peut également inhiber ou empêcher leur culture. Autres méthodes sur place à concentrer les cellules sans les exposer à l’oxygène pourraient faciliter l’isolement des bactéries EET-capable. Nous rapportons ici les détails de paramétrage concernant une technique électrochimique sur place afin d’enrichir le microbe EET-capable sur une longue période de temps sans la nécessité d’une source d’alimentation externe.

À l’aide de nos expériences d’electrocultivation provenant d’une source hautement alcaline en Californie du Nord, les cèdres¹⁰, les auteurs décrivent cette technique électrochimique sur place. La géochimie des ressorts à The Cedars sont affectées par la serpentinisation dans le sous-sol. Les ressorts sont très réductrices, avec la concentration d’oxygène inférieure à la limite de détection sous l’interface de l’eau air mettant en évidence le potentiel de production d’énergie microbienne par EET dans cet environnement anoxique fonctionnellement¹¹. Cependant, il n’y a aucune preuve pour étayer les microbes EET capable des Cèdres (dans les ARNr 16 s ou analyse métagénomique). Même si cet environnement a été caractérisé comme accepteur d’électrons limitée, la possibilité d’utiliser les minéraux insolubles comme accepteurs d’électrons terminal, y compris les minéraux comme le fer, découvrant des minéraux qui résultent de la serpentinisation (c.-à-d., magnétite), n’a pas été intensivement étudié¹². Nous avons, par conséquent, déployé notre système électrochimique au camping ressort, un pH élevé aux Cèdres, d’enrichir à EET capable de microbes (Figure1)¹³.

Protocol

1. construction d’un système de deux électrodes pour l’Incubation environnementale Préparation de la matière de l’anode et le traitement du carbone sentaient électrode (Figure 2). Couper le carbone estimé à dimensions égales selon l’enrichissement désiré de la biomasse. Tremper chaque électrode dans l’éthanol à 90 % pendant 30 min, puis rincer au moins 8 fois avec de l’eau désionisée, sonification pendant 1 min après chaque ri…

Representative Results

Production actuelle a été mesurée avec succès pendant environ 3 mois à l’aide d’un enregistreur de données de tension tel qu’illustré à la Figure 3. Ce moment a été choisi car c’était la plus longue période d’incubation stable pour le printemps, en raison de la forte chute des pluies qui affectent le printemps. Une période plus courte pourrait être suffisante, même si un délai plus long pourrait fournir un enrichissement plus fort de…

Discussion

Dans l’étude décrite, nous montrons l’enrichissement d’un consortium microbien, lié avec in situ la production actuelle. Les tendances observées dans l’actuel soutien l’activité microbienne dans ce système au fil du temps de courte et longue échelles. L’étape critique pour la construction d’un système fonctionnel deux électrodes (type de pile à combustible) identifie et utilisant un emplacement avec une écurie de niveau d’eau et la concentration d’oxygène dans l’environnement. La…

Materials

Carbon felt sheet	n/a	n/a	Used for anode and cathode
Titanium wire	The Nilaco Cooporation	TI-451485	Used to construct fuel cell system
Graphite epoxy	Electrolytica lnc.	n/a	Used to connect the electrodes and Ti wire
Drying oven	Yamato	DY300	bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy
Digital multi meter	Fluke	616-1454	to check the ohmic value of resistance
Dissolved oxygen probe	Sper Science	#  850045	to check the oxygen concentration in the environments
Resistor	Sodial		Used to construct fuel cell system
Conducting wire	Pico	81141s	Used to construct fuel cell system
Voltmeter and Data logger	T&D corporation	VR-71	Used for data recording
Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate	wako	18497-13-7	Used for electropolation
Citric acid	Wako	038-06925	Used for electropolation
Sulfuric acid	Wako	192-04696	Used for electropolation
HCl	Wako	083-01095	Used for electrode washing
Glass cylinder	N/A	N/A	Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base	N/A	N/A	Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber	N/A	N/A	Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa	GL Science	3007-16101	Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode	GEOMATEC	No.0001	Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode	HOKUTO DENKO	HX-R5	Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire	The Nilaco Cooporation	PT-351325	Used as a counter electrode
NaHCO3	Wako	191-01305	Used for The Cedars Media (CMS)
CaCO3	Wako	030-00385	Used for CMS
NH4Cl	Wako	011-03015	Used for CMS
MgCl2 • 6H2O	Wako	135-00165	Used for CMS
NaOH	Wako	198-13765	Used for CMS
Na2SO4	Wako	194-03355	Used for CMS
K2HPO4	Wako	164-04295	Used for CMS
CABS	SANTA CRUZ	SC-285279	Used for CMS
Incubator	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Used for precultivation
Autoclave machine	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench	SANYO	MCV-91BNF	Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator	Eppendorf	5430R	Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer	SHIMADZU	UV-1800	Used for optimization of cell density
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator	AS ONE	TR-1A	Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage	HOKUTO DENKO	HS-201S	Used for electrochemical experiments
Anaerobic Chamber	COY	TypeB (Vinyl)	TO conduct experiments under anaerobic condition
Ultraclean DNA Extraction kit	MoBio