Set-up elettrochimico autoportanti per arricchire i batteri respiring anodo in loco
Summary
Tecniche di coltivazione microbiche in loco di arricchimento o in situ possono facilitare l’isolamento dei taxa microbici difficile-a-cultura, soprattutto da ambienti basso-biomassa o geochimico estremi. Qui, descriviamo un assetto elettrochimico senza l’utilizzo di un alimentatore esterno per arricchire i ceppi microbici che sono capaci di trasporto dell’elettrone extracellulare (EET).
Abstract
Respirazione anaerobica accoppiato con trasporto di elettroni ai minerali insolubili (denominato extracellulare trasporto dell’elettrone [EET]) è pensato per essere critico per la produzione di energia microbica e persistenza in molti ambienti di sottosuolo, soprattutto quelli difettando di accettori terminali solubile. Mentre EET-capace microbi sono stati correttamente isolati da vari ambienti, la diversità di batteri capaci di EET è ancora poco capito, soprattutto nel difficile a campione, bassa energia o ambienti estremi, come molti di sottosuolo ecosistemi. Qui, descriviamo un sistema elettrochimico in loco per arricchire EET-capace batteri utilizzando un anodo come un accettore di elettroni terminale respiratoria. Questo anodo è collegato al catodo capace di catalizzare la riduzione dell’ossigeno abiotici. Paragonando questo approccio electrocultivation metodi che utilizzano un potenziostato per rettilineo il potenziale di elettrodo, il sistema del due-elettrodo non richiede un’alimentazione esterna. Presentiamo un esempio del nostro arricchimento in loco utilizzato in un stagno alcalino al Cedars, un sito di serpentinizzazione terrestre nella California del Nord. Precedenti tentativi di coltivare batteri riducendo minerali erano infruttuosi, che è probabilmente dovuto la natura di basso-biomassa di questo sito e/o l’abbondanza relativa bassa di metallo riducendo i microbi. Prima di implementare il nostro arricchimento di due elettrodi, abbiamo misurato il profilo verticale della concentrazione di ossigeno disciolto. Questo ci ha permesso di posizionare il carbonio feltro carbonio placcato platino e anodo catodo a profondità che sosterrebbe anaerobico ed aerobico elabora, rispettivamente. A seguito di incubazione in loco, abbiamo ulteriormente arricchito l’elettrodo anodico in laboratorio e confermato una comunità microbica distinta rispetto alla superficie associata o biofilm comunità normalmente osservate presso il Cedars. Questo arricchimento successivamente ha condotto all’isolamento del primo elettrogenico microbo da cedri. Questo metodo di arricchimento microbico in loco ha il potenziale per migliorare notevolmente l’isolamento di batteri EET-capace da biomassa bassa o difficili da habitat di campione.
Introduction
Diversi microbi riduzione del minerale sono stati indicati per utilizzare fase solida minerali come accettori terminali, dai processi di trasporto dell’elettrone extracellulare (EET) che conducono elettroni all’esterno della cella via redox enzimi1. EET è fondamentale, non solo per processi di microbo-minerale ma anche energia applicata e tecnologie ambientali, ad esempio celle a combustibile microbico2, elettrodo sintesi3e bioremediation4. EET-capaci nuovi batteri sono molto ricercati e sono state ampiamente studiati da un punto di vista fondamentale o applicata5. Tuttavia, abbiamo solo limitato spaccato il significato ecologico o biogeochimico di questi batteri. La maggior parte dei microbi EET-capace è stata isolata dopo arricchimento da aqua, sedimenti o digestori anaerobici utilizzando accettori solido come MnO2, Fe2O3 o elettrodi bilico in laboratorio6, 7 , 8. Tuttavia, questi metodi spesso producono simili consorzi e potenzialmente perdere taxa più sensibili che può dominare basso consumo energetico o sistemi a biomassa bassa, polarizzare la capacità di questi microbi di adattarsi al laboratorio o coltura axenica ambiente9 . Solitamente per gli ambienti di biomassa basso, grandi quantità di acqua da un sito vengono filtrati per concentrare le cellule batteriche. Tuttavia, batteri in grado EET esibiscono spesso metabolismi anaerobici e pertanto esposizione all’ossigeno potrebbe ulteriormente inibire o impedire la loro coltivazione. Metodologie alternative in loco per concentrare le cellule senza esporli a ossigeno potrebbero facilitare l’isolamento dei batteri EET-capace. Qui, segnaliamo i dettagli di installazione per una tecnica elettrochimica in loco arricchire microbo EET-capace per un lungo periodo di tempo senza la necessità di un alimentatore esterno.
Utilizzando i nostri esperimenti di electrocultivation da una sorgente altamente alcalina nel nord della California, i cedri10, descriviamo questa tecnica elettrochimica in loco. La geochimica delle sorgenti presso The Cedars sono risentito di serpentinizzazione nel sottosuolo. Le molle sono altamente riduttive, con concentrazioni di ossigeno inferiore al limite di rilevazione sotto l’interfaccia di acqua aria mettendo in evidenza il potenziale di produzione di energia microbica attraverso EET in questo ambiente funzionalmente anossico11. Tuttavia, non vi è alcuna prova a sostegno di microbi EET-capace da cedri (in 16S rRNA o analisi metagenomica). Anche se questo ambiente è stato caratterizzato come accettore di elettroni limitato, il potenziale per l’utilizzo di minerali insolubili come accettori terminali, compreso i minerali come il ferro che scopre minerali che derivano da serpentinizzazione (vale a dire, magnetite), non è stato estesamente esaminatori12. Abbiamo, pertanto, distribuito il nostro sistema elettrochimico al campeggio Spring, una sorgente di pH elevato ai cedri, per arricchire per EET-capace di microbi (Figura1)13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nello studio descritto, vi mostriamo l’arricchimento di un consorzio microbico, collegato con la produzione di corrente in situ . I modelli osservati in corrente supporto attività microbica in questo sistema nel breve e lungo tempo scale. Il passaggio fondamentale per la costruzione di un sistema funzionale del due-elettrodo (tipo di cella a combustibile) è identificando ed utilizzando una posizione con una scuderia di livello dell’acqua e la concentrazione di ossigeno nell’ambiente. Il catodo è esposto all’o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere Roger Raiche e David McCrory per consulenza su posizioni per l’incubazione di lungo termine e che ci permette di raggiungere i cedri. Ringraziamo anche la squadra del campo Cedars durante la stagione 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam e Matthew Schechter. Additional grazie Shino Suzuki e Gijs Kuenen per ricerca penetrante e la coltura di supporto. Questo lavoro è stato finanziato attraverso una sovvenzione per giovani scienziati A e B della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI concessione numero 17H 04969 e 26810085, rispettivamente e l’Agenzia giapponese per la ricerca medica e lo sviluppo (17gm6010002h0002). Finanziamento degli Stati Uniti fornito da noi Office di Global Naval Research (N62909-17-1-2038) e il centro per indagini di Dark Energy della biosfera (C-DEBI) (OCE0939564) e l’Istituto di Astrobiologia della NASA – vita metropolitana (NAI-LU) (NNA13AA92A). Parte di questo lavoro è stato condotto come parte di una società del Giappone per la promozione delle scienze: a breve termine postdoctoral fellowship per Annette Rowe (PE15019) presso l’Università di Tokyo nel laboratorio di Kazuhito Hashimoto.
Materials
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
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