Preparación electroquímica autónomo para enriquecer bacterias respirando de ánodo en el sitio
Summary
Técnicas de cultivo microbianas in situ del enriquecimiento o en situ pueden facilitar el aislamiento de difícil-a-cultura microbianos taxa, especialmente desde entornos de baja biomasa o geoquímicamente extremas. Aquí, describimos una configuración electroquímica sin utilizar una fuente de energía externa para enriquecer las cepas microbianas que son capaces de transporte de electrones extracelular (EET).
Abstract
Respiración anaerobia juntada con el transporte de electrones a los minerales insolubles (denominado transporte de electrones extracelular [OTA]) se cree que es crítico para la producción energética microbiana y persistencia en ambientes subterráneos, especialmente los carecer de aceptadores del electrón terminal soluble. Mientras que los microbios capaces de EET se han aislado con éxito de varios ambientes, la diversidad de bacterias capaces de EET es todavía mal entendida, especialmente en difícil-a-sample, baja energía o ambientes extremos, tales como muchos subsuperficial ecosistemas. Aquí, describimos un sistema electroquímico in situ para enriquecer bacterias EET capaz mediante un ánodo como aceptor terminal de electrones respiratorio. Este ánodo está conectado a un cátodo capaz de catalizar la reducción de oxígeno abióticos. Comparando este método con los métodos electrocultivation que usar un potenciostato para gemir el potencial de electrodo, el sistema de dos electrodos no requieren una fuente de energía externa. Presentamos un ejemplo de nuestro enriquecimiento in situ en un estanque de alcalino en los cedros, un sitio serpentinization terrestre en el norte de California. Anteriores intentos de cultivar bacterias reduciendo minerales eran fracasados, que es probablemente debido a la naturaleza de la biomasa, baja de este sitio o la baja abundancia relativa de metal reducción de microbios. Antes de implementar nuestro enriquecimiento de dos electrodos, medimos el perfil vertical de la concentración de oxígeno disuelto. Esto nos ha permitido colocar el carbón fieltro fieltro ánodo y carbono platino electrochapado procesos de cátodo a profundidades que apoyaría aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente. Tras incubación in situ, más había enriquecido el electrodo anódico en el laboratorio y confirmó una comunidad microbiana distinta en comparación con la superficie adjunta o comunidades biofilm normalmente observadas en los cedros. Este enriquecimiento posteriormente condujo al aislamiento del microbio electrógenos primera de los cedros. Este método de enriquecimiento microbiano in situ tiene el potencial de mejorar enormemente el aislamiento de bacterias capaces de EET de la biomasa baja o difícil hábitat muestra.
Introduction
Han demostrado varios microbios reductores de mineral a utilizar minerales de fase sólida como aceptadores terminales del electrón, por procesos de transporte de electrones extracelular (EET) que realizan los electrones hacia el exterior de la célula a través de las enzimas redox1. EET es crítica, no sólo para procesos de microbios y minerales pero también energía aplicada y tecnologías del medio ambiente, tales como las células de combustible microbianas2, electrodo síntesis3y bioremediación4. Nuevas bacterias capaces de EET son muy buscadas y se han estudiado ampliamente desde un punto de vista fundamental o aplicada5. Sin embargo, sólo hemos limitada penetración en el significado ecológico o biogeoquímico de estas bacterias. La mayoría de los microbios capaces de EET se ha aislado tras enriquecimiento de aqua, sedimento o digestores anaerobios utilizando aceptadores del electrón sólido como MnO2, Fe2O3 electrodos posicionados en el laboratorio6, 7 , 8. sin embargo, estos métodos a menudo producen consorcios similares y potencialmente perder taxones más sensibles que pueden dominar el bajo consumo de energía o sistemas de biomasa baja, sesgar la capacidad de estos microbios para adaptar al laboratorio o axénicos cultura medio ambiente9 . Generalmente para los entornos de baja biomasa, se filtran grandes cantidades de agua de un sitio para concentrar las células bacterianas. Sin embargo, bacterias capaces de EET a menudo exhiben metabolismos anaerobios y por lo tanto exposición al oxígeno adicional puede inhibir o impedir su cultivo. Metodologías alternativas in situ para concentrar células sin exponer al oxígeno pueden facilitar el aislamiento de bacterias capaces de EET. Aquí, Divulgamos los datos de configuración de una técnica electroquímica in situ enriquecer microbios capaces de EET durante un largo período de tiempo sin necesidad de fuente de energía externa.
Utilizando nuestros experimentos de electrocultivation de un manantial fuertemente alcalino en California del norte, los cedros10, se describe esta técnica electroquímica in situ. La geoquímica de los resortes en los cedros se ven afectados por serpentinization en el subsuelo. Los resortes son altamente reductivos, con concentraciones de oxígeno por debajo del límite de detección bajo la interfaz de aire agua destacando el potencial para la producción de energía microbiana vía OTA en este ambiente anóxico funcionalmente11. Sin embargo, no hay ninguna evidencia para apoyar microbios capaces de EET de los cedros (en 16S rRNA o análisis de metagenómica). A pesar de este entorno se ha caracterizado como aceptador del electrón limitado, el potencial para el uso de minerales insolubles como aceptadores del electrón terminal, incluyendo minerales como el hierro, minerales que resultan de serpentinization (es decir, dejando al descubierto Magnetita), no ha sido extensivamente investigada12. Por lo tanto, implantamos nuestro sistema electroquímico en el camping resorte, un pH elevado en los cedros, para enriquecer de EET-capaz de microbios (figura1)13.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el estudio descrito, se muestra el enriquecimiento de un consorcio microbiano, vinculado con la producción actual de en situ . La escala de los patrones observados en la actividad microbiana apoyo actual en este sistema en el corto y largo tiempo. El paso crítico para la construcción de un sistema funcional de dos electrodos (tipo de célula de combustible) es identificar y utilizar una ubicación con un estable nivel de agua y concentración de oxígeno en el medio ambiente. El cátodo está expuesto al o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer Roger Raiche y David McCrory nos permite el acceso a los cedros y la consulta sobre lugares para la incubación de largo plazo. También agradecemos al equipo de campo de los cedros durante la temporada 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam y Matthew Schechter. Adicional gracias a Shino Suzuki y Gijs Kuenen de profunda investigación y cultivo de apoyo. Este trabajo fue financiado a través de una subvenciones para jóvenes científicos A y B de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI Grant número 17H 04969 y 26810085, respectivamente y la Agencia Japonesa para la investigación médica y el desarrollo (17gm6010002h0002). Estados Unidos fondos provistos por el nos oficina de Naval investigación Global (N62909-17-1-2038) y el centro de investigaciones de la Biosfera de energía oscura (C-DEBI) (OCE0939564) y el Instituto de Astrobiología de la NASA – vida subterránea (NAI-LU) (NNA13AA92A). Parte de este trabajo se realizó como parte de una sociedad de Japón para la promoción de las Ciencias: a corto plazo beca postdoctoral para Annette Rowe (PE15019) de la Universidad de Tokio en el laboratorio de Kazuhito Hashimoto.
Materials
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
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