効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から
Summary
ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC 由来細胞、遺伝子操作、スクリーニングに適しています。
Abstract
ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、再生医療と人間の発達過程を研究するためのプラットフォームのための有望な細胞ソース。段階的発達過程を繰り返す分化、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+を含む膵細胞を生成する主要な方法の 1 つを監督 (PDX1+) 膵前駆細胞。従来のプロトコルは、通過後すぐの小さいコロニーと分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態で細胞が不均一性は、PDX1 への分化を妨げる可能性がありますになりやすい+細胞。PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+のセル。プロトコルは 4 つのステップで構成されています、シード解離単一細胞で分化を開始します。SOX17 の誘導+ PDX1 に決定的な内胚葉細胞 2 つの原始腸チューブ マーカー、HNF1β、HNF4α、および最終的な分化の式が続いた+細胞。議定書簡単処理を提供しますと改善や内胚葉系統または PDX1 に効率的に区別するために以前に発見されたいくつかの hPSC ラインの分化効率を安定させる+細胞。
Introduction
膵臓は外分泌と内分泌の細胞の主し、その機能不全またはオーバー ロードを引き起こすいくつかの疾患、膵炎、糖尿病、膵臓癌など。Pancreatopathy の病因を解明するには、発達過程と膵臓の細胞の機能を分析する必要は。また、細胞・組織の補充療法を確立する堅牢な品質と安定した供給が必要です。ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、これらの目的の有望な細胞ソースと膵臓細胞へ分化プロトコルは集中的に調査1,2,3をされています。 4。膵 β 細胞の in vitro 生成における最近の進歩は、人間、大人の糖尿病モデル マウス2,3への注入時にこれらの細胞の治療効果 β 細胞の生成を模倣します。さらに、健康の誘導多能性幹細胞 (Ips) と 1 型糖尿病患者のドナーから生成された β 細胞の解析はストレス5のとき下を含む機能の相違を認めなかった。さらに、疾患表現型が部分的に患者由来の Ips または hPSCs 患者6,7と同じサイトで遺伝子変異を遺伝的に膵細胞の再現します。
膵臓の細胞を生成すると、hPSCs から、発達過程を繰り返す段階的分化を使用します。膵臓は地域 Y ボックス 17 (SOX17) を決定性を表現する初期胚の内胚葉層から派生した、フォーク ヘッド ボックス A2 (FOXA2)8。マウス研究に基づいて、内皮層は肝細胞核因子 1-β (Hnf1β) と肝細胞核因子 4 アルファ (Hnf4α) の式によってマークされている原始腸の管を形成します。原始腸の管を延長し、呼吸器、消化管や臓器に成長します。伸び後、臼歯前腸地域なる推定膵領域 1 (PDX1)8,9,10転写因子膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質の表現によって示されるように。背側と腹側部、PDX1+ 1 (NKX6.1)8,11膵臓転写因子 1 サブユニット α (PTF1A) および NK6 ホメオ ボックスの共発現によってマークされているフォーム膵芽腸チューブが厚きます。この式は、膵の器官の形態の開始をマークします。膵臓の芽のコンポーネントである膵臓内胚葉細胞上皮構造12分岐管ネットワークを形成し、最終的にインスリン分泌 β 細胞を含む、外分泌と内分泌の細胞に分化し、グルカゴン分泌 α-細胞。PDX1 の式は全体の膵開発全体を通して観察し、β、δ 細胞9,13,14にローカリゼーションを示します推定の膵領域で最初に検出されました。ただし、Pdx1+ Ptf1a または Nkx6.1 を表現していないセル領域を胃幽門部、十二指腸、胆管、マウス9、PDX1 開発の後期段階にいくつかの腸の細胞に区別する+細胞は、人間の初期の発達段階では膵前駆細胞と見なされます。
PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+細胞膵臓系譜の生成のため。播種によるプロトコル開始分化には、単一細胞15,16,17が分離されます。一般的に、画一的な hPSCs、植民地または懸濁液、接着性細胞集塊として維持されます。その結果、ほとんどのプロトコルは、通過直後に分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態でセルが空間と転写不均質18,19,20,21,22を妨げる可能性がありますになりやすい、決定的な内胚葉の分化第一歩は PDX1 に非効率的な分化に続く+細胞。この議定書の分化効率を安定させるために改善し扱いやすさを提供するかもしれない以前発見されたいくつかの hPSC ライン内胚葉系統および PDX1 に効率的に区別するために+細胞23,24,25。
Protocol
HPSCs を用いた実験は、医学科と京都大学大学院医学研究倫理委員会で承認されました。 1 材料の準備 注:無菌環境で細胞培養のため、すべてのメディアと試薬を準備します。ウォーム アップを使用する前に室温 (RT) 基本培地。媒体の差別化は試薬のルート詳細を 6 時間以内に使用される材料のテーブルに表示され?…
Representative Results
伝搬 hiPSCs (585A129,30) 凝縮と分化に適した均質な膜 (図 1 b)。画一的な hiPSCs (ステージ 0) 解離、低細胞密度 (1 〜 1.5 × 105セル/cm2) にある単一セルとして再シードします。1 h 内のセルは、プレートに取り付け、突起を表示を開始します。1 日目、セルを増殖して表面積の 80-90% をカバーする分散も。ステージ 1 b の?…
Discussion
PDX1 の世代+のセルが複数の手順で構成されていますしたがって、適切な時期に細胞を治療するために重要です。手順の中で決定的な内胚葉の誘導効率主最終誘導効率に影響を与える、おそらく他汚染系統の細胞 (すなわち、中胚葉と外胚葉) 増殖または分泌することができるからの干渉によって要因特定の分化を混乱させます。場合 SOX17 の割合+ 80% 未満の細胞は日 4 (ステージ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事はから資金援助によって日本社会のための科学振興) Scientific Research (C) (日本学術振興会科研費補助金 Number15K09385 と 18 K 08510) を通じてに科研費と技術移転、日本学術振興会研究員 (日本学術振興会科研費助成番号の部分で支えられました17J07622) A.K.、および医学研究開発 (アメッド) その研究を通じて機構に k. o. に「iPS 細胞研究、再生医療実現に向けた研究センター ネットワークの中核拠点」を付与著者が原稿を読んで博士ピーター Karagiannis をありがちましょう。
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
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Citer Cet Article
Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).